乙酰膽堿調控缺氧誘導Connexin43磷酸化表達

黃柳桓，張亞南，康熙雄

（1.首都醫科大學石景山教學醫院·北京市石景山醫院 胸外科，北京100043；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院 檢驗科，北京100050）

心臟疾病諸如心肌梗死、慢性心衰和心肌肥大與心肌細胞的細胞偶聯改變相關。縫隙連接蛋白43（Connexin 43，Cx43）是心室電偶聯的主要蛋白，動物試驗證明Cx43基因突變小鼠雖然有正常心臟結構和收縮功能，但2個月內容易因自發性室性心律失常而死于心源性猝死［1］。缺血／再灌注損傷機制的研究發現因缺血誘導的細胞脫偶聯和Cx43去磷酸化，使Cx43從縫隙連接轉移進入細胞池而改變細胞間通訊信號［2，3］。Cx43含量、分布及其磷酸化的改變和異常表達導致心肌細胞功能阻滯，形成陣發性室性心動過速［4］。

乙酰膽堿（ACh）是內皮依賴性血管擴張劑，藥理作用是模擬缺血預處理，使心臟在隨后出現的缺血環境下抵御梗死、預防梗死、防止冠狀動脈阻塞或心臟病發作［5］。ACh通過上調 TNF receptor－2和下調 TNF receptor－1［6］、抑制缺氧誘發細胞凋亡［7］抵御缺血等多種途徑保護心臟，然而在缺氧條件下ACh增加Cx43磷酸化保護心臟的作用機制仍不清。我們曾報導ACh可抑制缺氧引起Cx43表達降低并恢復Cx43功能［8］，本文繼續討論在缺氧條件下H9c2細胞Cx43磷酸化動態變化及ACh誘導Cx43分布改變。

1 材料與方法

1.1 細胞培養和藥物制劑

用含有10%胎牛血清（Sigma）、青霉素（100IU）、鏈霉素（100μg／ml）的 DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）（Sigma）培養液培養H9c2細胞，置于5%CO2、37℃培養箱。ACh（Sigma，1mM）預處理 H9c2細胞1小時，隨后置于37℃、5%CO2，10%H2和85%N2的缺氧環境1小時。一氧化氮合成酶抑制劑N－硝基－L－精氨酸甲酯（N－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）（Sigma，1mM）與ACh共同處理細胞1小時，隨后缺氧1小時。PKC抑制劑白屈菜赤堿（chelerythrine）（Sigma，5μM），ATP敏感鉀通道阻滯劑格列本脲（Glybenclamide）（Sigma，10μM），K－ATP 激動劑二氮嗪（Diazoxide）（Sigma，100μM）進行相同試驗。缺血預處理是缺氧環境5min，隨后正常氧環境5 min，反復3個循環周期。

1.2 免疫印跡

在相應動態時間內提取細胞蛋白備用免疫印跡［8］。細 胞 裂 解 液 ［50mM Tris－HCl（pH6.8），10% （wt／vol）十二烷基硫酸鈉，12% （vol／vol）二巰基乙醇，0.1% （vol／vol）溴酚藍（BPB），20%（wt／vol）甘油］裂解細胞，離心收集上清，進行10%聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate－polyacrylamid gel electrophoresis，SDS－PAGE））電泳，轉移蛋白到硝酸纖維膜上，第一抗體采用抗Cx43抗體（1∶1 000，Zymed），第二抗體采用抗兔IgG 抗體（1／1 000，BD），ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（Amersham Biosciences）顯像分析。а－tubulin做對照，定量蛋白帶密度用Bldis軟件處理。

1.3 免疫組織化學

H9c2細胞用含4%多聚甲醛PBS室溫固定，0.1%Triton X－100的PBS處理細胞，5%脫脂牛乳孵育過夜，抗Cx43抗體（Zymed）孵育4℃過夜，Cy3標記第二抗體（（Jackson ImmunoReserch）孵育4℃過夜。肌動蛋白用FITC標記FITC－conjugated phalloidin做背景對照。

1.4 統計學

2 結果

2.1 缺氧誘導Cx43磷酸化

Cx43有兩種形式，磷酸化Cx43（P－Cx43）和非磷酸化 Cx43（NP－Cx43）（圖 1）。我們曾報道［8］H9c2細胞暴露在缺氧環境中，隨著時間延長0、30、60min的P－Cx43和NP－Cx43呈現漸進性減少，60 min呈現顯著抑制 （P＜0.001vs 0min of hypoxia）。但是120min、240min呈現逐漸恢復，與60 min比較，雖然240min P－Cx43逐漸恢復（P＜0.001vs 60min of hypoxia），但是仍低于0min PCx43（P＜0.001vs 0min of hypoxia）。結果提示缺氧造成Cx43磷酸化的急速降低，隨后逐漸恢復。

圖1 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環境下不同時間點的Cx43表達

2.2 ACh誘導Cx43磷酸化

為驗證ACh是否調控Cx43磷酸化，我們用ACh處理H9c2細胞，Cx43磷酸化迅速升高持續至10min（P＜0.001vs 0min）（圖2），隨后逐漸降低（P＜0.001vs 10min）（圖2），峰值5min。

2.3 ACh抑制缺氧誘導Cx43降低

為了解在缺氧條件下ACh是否調控Cx43，用ACh預處理細胞1小時，隨后缺氧1小時，ACh抑制缺氧條件下Cx43磷酸化降低 （P＜0.001vs hypoxia）（圖3）。同樣結果觀察在具有減少心肌壞死和保護心臟作用的缺血預處理的Cx43（圖3）。

圖2 Western blot檢測H9c2細胞在正常氧環境下ACh誘導不同時間點的Cx43表達

圖3 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環境下不同調控方法的Cx43表達

進一步用免疫組化證實ACh調控Cx43。正常氧環境下可見Cx43表達，缺氧引起Cx43表達降低，然而ACh恢復缺氧誘導降低的Cx43表達。結合免疫印跡結果ACh抑制缺氧誘導Cx43磷酸化降低，恢復／激活Cx43功能。

2.4 ACh通過NO、ATP、KPC介導缺氧誘導Cx43磷酸化

為了解ACh誘導Cx43信號通路，我們研究化學藥物是否誘導Cx43表達（圖4）。在缺氧條件下，L－NAME抑制Cx43升高 （P＜0.001vs ACh＋hypoxia），同樣結果觀察在 Diazoxide（P＜0.05vs ACh ＋ hypoxia），而 Chelerythrine 和 Glybenclamide沒有呈現抑制作用。

3 討論

圖4 Western blot檢測H9c2細胞在缺氧環境下不同化學藥物調控Cx43表達

慢性缺血性心臟疾病與縫隙連接蛋白功能失調相關。縫隙連接生理功能依賴于組成縫隙連接通道的開放和關閉，而這種通道開放和關閉取決于連接蛋白，Cx43與其它細胞間分子ZO－1和鈣黏蛋白共同調控心肌細胞［9，10］。Cx43磷酸化便于縫隙連接通道形成、開放和Cx43非磷酸化轉換［11］，絲氨酸368、325、328和（或）330磷酸化在缺血早期可以影響通 道 選 擇 通 透 性 和 調 控 縫 隙 連 接 功 能［12，13］。Cx43磷酸化定位于閏盤，當心臟缺氧時Cx43在閏盤發生去磷酸化，重新在質膜分布［14］。本研究證明在缺氧條件下Cx43磷酸化和非磷酸化有顯著降低（圖5），提示缺氧激發縫隙連接蛋白改變。Beardslee等報道缺氧誘導的解偶聯與Cx43去磷酸化相關，在縫隙連接內Cx43非磷酸化集聚，Cx43從縫隙連接遷移到細胞池［3］，而本研究未發現Cx43非磷酸化積聚（圖5）。

圖5 缺氧環境下不同時間點的Cx43表達水平比較分析

雖然大量文獻報道Cx43在SDS－PAGE 44－46 kDa和41kDa分別表現Cx43磷酸化和非磷酸化異構體，但并沒有清晰證據證明哪個Cx43特異磷酸－氨基酸殘基和Cx43磷酸異構體多樣性與心臟疾病相關，推測Cx43磷酸異構體多樣性的可能原因是單克隆抗體能夠檢測遷移在SDS－PAGE分子量44－46kDa附近的幾種Cx43磷酸化異構體［4］。

為進一步了解ACh誘導Cx43磷酸化機制，我們選擇不同化學藥物NO抑制劑、蛋白酶C抑制劑、ATP激活劑和阻滯劑誘導和分析Cx43表達探討ACh調控Cx43通路機制。NO主要生理功能是與可溶性鳥苷酸環化酶結合增加cGMP產生，cGMP調控多種信號通路激活蛋白酶C或cAMP保護心臟。在缺血再灌注中PKC抑制劑增加預處理效果減少梗死面積、減輕收縮功能障礙和心律失常。Diazoxide通過抑制線粒體ATP合成酶［15］、激活鉀通道而保護心臟作用［16］。本研究證明NO和ATP鉀離子通路參與ACh上調Cx43表達的作用機制。

短暫的心肌缺血可增加心臟對隨后缺氧的耐受力，這種現象稱為缺血預處理（ischemic preconditioning，IP）。IP是一種心肌保護措施，可顯著降低心肌壞死和心肌缺血／再灌注損傷。本研究證明在缺氧條件下ACh調控Cx43蛋白具有與IP相同保護效果（圖3），可能的機制是Cx43羧基末端結構參與分子內和分子間相互作用調控縫隙連接［17］，ACh激活Cx43重新分布［18，19］，上調缺氧抑制的Cx43磷酸化表達，維持Cx43的磷酸化水平，高濃度Cx43磷酸化關閉縫隙連接通道作用，從而降低心肌細胞離子超載而發揮處于缺氧條件下心肌保護作用。ACh抑制缺氧引起Cx43磷酸化的降低仍有待進一步研究，可以肯定ACh誘導Cx43的心臟保護作用不是一個因子而是多個因子共同參與綜合作用的結果。Cx43異常表達影響心室肌細胞間電偶聯的穩定，導致功能阻滯，誘發心律不齊［20］，因冠狀動脈粥樣硬化性狹窄而誘發急性心肌缺血是臨床心性猝死最常見原因之一，Cx43磷酸化改變是心肌缺血／缺氧引起心肌損傷的早期征兆，為進一步研究心臟疾病的診斷、治療和監測提供可能；ACh作為激活因子激活內源性心臟保護的信號通路，為今后藥物的研究和開發提供可能。

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