hAP－2α轉錄因子酵母雙雜交誘餌載體的構建及自激活檢測

黃前川，楊長亮，曹軍皓，丁進亞

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院1.檢驗科；2.耳鼻喉科，湖北 武漢430070）

AP－2（activator protein 2）為一類轉錄因子家族，包括5個成員，即 AP－2α，β，γ，δ和ε，分子量約為52kDa，參與發(fā)育、分化和凋亡等生理過程［1］。已證實過度表達的HER－2是乳腺癌預后不良及藥物治療靶點［2］，HER－2基因啟動子上有人 hAP－2α（human activator protein 2alpha，hAP－2α）的結合位點，因而 hAP－2α可以促進 HER－2基因轉錄［3］，免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中hAP－2α與HER－2表達明顯正相關［4］，可見 hAP－2α高表達是乳腺癌一個重要的分子標志。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)一些hAP－2α結合蛋白參與hAP－2α介導的乳腺癌病變過程。這些蛋白包括 DEK［5］和 Yin Yang 1［6］等。它們本身不是轉錄因子，但是可以結合轉錄因子而增強其轉錄活性。本實驗旨在構建hAP－2α轉錄因子酵母雙雜交誘餌載體，為進一步系統(tǒng)分析hAP－2α及其相互作用蛋白在乳腺癌發(fā)生機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌表達載體質粒pGBKT7、系統(tǒng)陽性對照質粒pGBK7－53，陰性對照質粒pGBKT7－Lam和酵母工程菌株AH109均購自美國Clontech公司；大腸埃希桿菌DH5α為本實驗室保存菌株；宮頸癌Hela細胞株由武漢大學基礎醫(yī)學院提供；T4DNA連接酶購自美國Promega公司；限制性內切酶、MulV Reverse Transcriptase均購自加拿大Ferments公司；Trizol試劑購自美國Invit rogen公司；Myc單克隆抗體購自碧云天生物技術研究所；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hAP－2α表達序列的克隆 常規(guī)培養(yǎng)和傳代宮頸癌Hela細胞株，使用Trizol裂解法提取細胞總mRNA，逆轉錄合成cDNA；取1μl cDNA為模板，依次在PCR反應體系中加入反應物：10×緩沖液2.5μl、dNTP 0.5μl、hAP－2α引物各（50mmol／L）0.5μl、Taq酶 0.5μl和ddH2O 19.5μl；PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃30s，63℃35s，72℃50s，循環(huán)30次；72℃10min。引物設計如下：3’－CGGAATTCATGCTTTGGAAATTGACG G－5’，3’－AGTCGACTCACTTTCTGTGCTTCTC CT－5’，分別在兩端引入酶切位點SalⅠ和EcoRⅠ；1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物目的條帶。

1.2.2 構建pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌載體 hAP－2α基因擴增產物和pGBKT7載體用SalⅠ、EcoRⅠ酶切，用 T4DNA 連接酶連接hAP－2α 基因和pGBKT7載體酶切產物，將連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞后進行培養(yǎng)；挑取陽性克隆，抽提重組質粒，進行測序鑒定及酶切鑒定。

1.2.3 重 組 質 粒 pGBKT7－h(huán)AP2α 轉 化 酵 母AH109菌株及鑒定 用PEG／LiAc法將誘餌質粒pGBKT7－h(huán)AP2α和構建獵物質粒載體pACT2轉化入酵母感受態(tài)細胞AH109，將轉化有重組質粒的感受態(tài)細胞涂布于SD－Leu－Trp平板，30℃培養(yǎng)2－3d，將長出的克隆連同陰陽對照一起接種于新的SD－Leu－Trp平板上，30℃維持生長12h，復制至SD－Leu－Trp－His－Ade營養(yǎng)缺陷型平板做自激活活性鑒定。

1.2.4 蛋白質印跡技術分析誘餌質粒pGBKT7－h(huán)AP2α蛋白表達 用醋酸鋰法將pGBKT7－AP2α轉化酵母細胞AH109，在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基上進行篩選，挑取2－3mm大小的菌落過夜培養(yǎng)后，提取酵母蛋白質表達產物進行Western免疫印跡分析。由于酵母表達載體pGBKT7的多克隆位點帶有人Myc標簽，我們所表達的融合蛋白亦帶有此標簽，所以用抗人Myc單克隆抗體可與之產生免疫反應。同時提取AH109空菌蛋白作為陰性對照。

2 結果

2.1 hAP2α基因的擴增

紫外分光光度計測定總mRNA濃為2.21μg／μl，A260／A280吸光度比值為1.87，說明總 mRNA濃度和純度均高，反轉錄為cDNA后成功擴增出目的基因hAP2α，經1%的瓊脂糖凝膠電泳可見擴增產物位于1 300bp左右處，與目的基因大小相吻合（圖1）。

2.2 pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌載體構建

將hAP2α基因與載體pGBKT7構建的誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α轉化DH5α感受態(tài)細胞，搖菌提取質粒，電泳鑒定，可見大小約8 600bp左右的pGBKT7－h(huán)AP2α連接產物（圖2），并且hAP2α測序正確（結果未顯示）；用SalI和EcoRI雙酶切后鑒定，可見1 300bp的hAP2α基因和7 300bp左右的pGBKT7（圖3），條帶大小與預期結果一致，說明誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α構建正確。

圖2 pGBKT7－h(huán)AP2α連接產物電泳

圖1 AP2α擴增產物電泳

圖3 重組質粒pGBKT7－AP2α用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定

2.3 誘餌蛋白自激活檢測

轉化pGBKT7－h(huán)AP2α重組質粒的AH109感受態(tài)細胞能夠在SD－Leu－Trp選擇皿上生長（圖4－B），不能在SD－Leu－Trp－His－Ade（圖4－C）選擇皿上生長，而系統(tǒng)陽性對照轉化子可在SD－Leu－Trp－His－Ade選擇皿上生長（圖4C）），證明沒有自身激活報告基因的活性，無需3AT抑制。所用的酵母菌株為Clontech系統(tǒng)的AH109，陽性對照PC為pGADT7－T＋ pGBKT7－53，陰 性 對 照 NC 為pGADT7－T＋pGBKT7－Lam。

2.4 蛋白質印跡分析pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌蛋白的表達

圖4 誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α自激活鑒定

提取未轉化質粒（對照組）與轉化了pGBKT7－h(huán)AP2α質粒（實驗組）的酵母蛋白質，Western免疫印跡分析結果顯示：對照組無表達，而實驗組可見明顯目的條帶且無雜帶，該融合蛋白的相對分子質量大小約52KD，條帶大小與預期結果相一致，說明該誘餌質粒在AH109酵母細胞中能穩(wěn)定表達。

圖5 pGBKT7－h(huán)AP2α在酵母細胞表達的Western blotting結果

3 討論

hAP轉錄因子家族與乳腺癌的發(fā)生相關，其中hAP－1轉錄因子在乳腺癌的形成、轉移和侵襲中發(fā)揮重要作用［7］，而hAP－2α轉錄因子高表達則促進HER－2癌基因的轉錄而導致乳腺癌。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制乳腺癌細胞中hAP－2α可引起細胞中HER2－mRNA及其蛋白的表達水平顯著下降，同時癌細胞的生長受抑制，提示hAP－2α基因在乳腺癌細胞的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［8］，進一步研究則發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中DEK蛋白促進乳腺癌中hAP－2α對 HER2轉錄作用［4］，DEK 這類自身不是轉錄因子，卻能與hAP－2α形成復合物并增強hAP－2α轉錄活性的蛋白叫做轉錄共激活因子［9］，具有協(xié)同hAP－2α參與乳腺癌的發(fā)生。因此，系統(tǒng)地鑒定hAP－2α結合蛋白并探討它們在乳腺癌發(fā)病中的作用將有利于闡明hAP－2α的致癌機制，這些hAP－2α結合蛋白本身也可以成為潛在的腫瘤標志物和藥物治療的靶點，對于乳腺癌的預防和治療將具有重要意義。

本實驗將hAP2α基因克隆于含有Myc標簽的pGBKT7載體中，正確構建誘餌質粒pGBKT7－h(huán)AP2α，Myc標簽單克隆抗體所檢測融合蛋白大小與預期的hAP2α融合蛋白質一致（圖5），說明hAP2α蛋白在酵母中表達成功，并且無自激活作用（圖4），誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α的構建不僅為下一步應用酵母雙雜交技術尋找乳腺癌中未知hAP2α作用蛋白奠定了基礎，同時也為尋找新的乳腺癌標志物和治療靶點提供了研究方法。

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