hAP－2α轉(zhuǎn)錄因子酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及自激活檢測(cè)

黃前川，楊長(zhǎng)亮，曹軍皓，丁進(jìn)亞

（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院1.檢驗(yàn)科；2.耳鼻喉科，湖北 武漢430070）

AP－2（activator protein 2）為一類轉(zhuǎn)錄因子家族，包括5個(gè)成員，即 AP－2α，β，γ，δ和ε，分子量約為52kDa，參與發(fā)育、分化和凋亡等生理過程［1］。已證實(shí)過度表達(dá)的HER－2是乳腺癌預(yù)后不良及藥物治療靶點(diǎn)［2］，HER－2基因啟動(dòng)子上有人 hAP－2α（human activator protein 2alpha，hAP－2α）的結(jié)合位點(diǎn)，因而 hAP－2α可以促進(jìn) HER－2基因轉(zhuǎn)錄［3］，免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中hAP－2α與HER－2表達(dá)明顯正相關(guān)［4］，可見 hAP－2α高表達(dá)是乳腺癌一個(gè)重要的分子標(biāo)志。最近幾年的研究發(fā)現(xiàn)一些hAP－2α結(jié)合蛋白參與hAP－2α介導(dǎo)的乳腺癌病變過程。這些蛋白包括 DEK［5］和 Yin Yang 1［6］等。它們本身不是轉(zhuǎn)錄因子，但是可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建hAP－2α轉(zhuǎn)錄因子酵母雙雜交誘餌載體，為進(jìn)一步系統(tǒng)分析hAP－2α及其相互作用蛋白在乳腺癌發(fā)生機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 酵母雙雜交系統(tǒng)的誘餌表達(dá)載體質(zhì)粒pGBKT7、系統(tǒng)陽性對(duì)照質(zhì)粒pGBK7－53，陰性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7－Lam和酵母工程菌株AH109均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；大腸埃希桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；宮頸癌Hela細(xì)胞株由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；T4DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司；限制性內(nèi)切酶、MulV Reverse Transcriptase均購(gòu)自加拿大Ferments公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invit rogen公司；Myc單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hAP－2α表達(dá)序列的克隆 常規(guī)培養(yǎng)和傳代宮頸癌Hela細(xì)胞株，使用Trizol裂解法提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；取1μl cDNA為模板，依次在PCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)物：10×緩沖液2.5μl、dNTP 0.5μl、hAP－2α引物各（50mmol／L）0.5μl、Taq酶 0.5μl和ddH2O 19.5μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，63℃35s，72℃50s，循環(huán)30次；72℃10min。引物設(shè)計(jì)如下：3’－CGGAATTCATGCTTTGGAAATTGACG G－5’，3’－AGTCGACTCACTTTCTGTGCTTCTC CT－5’，分別在兩端引入酶切位點(diǎn)SalⅠ和EcoRⅠ；1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物目的條帶。

1.2.2 構(gòu)建pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌載體 hAP－2α基因擴(kuò)增產(chǎn)物和pGBKT7載體用SalⅠ、EcoRⅠ酶切，用 T4DNA 連接酶連接hAP－2α 基因和pGBKT7載體酶切產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)；挑取陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序鑒定及酶切鑒定。

1.2.3 重 組 質(zhì) 粒 pGBKT7－h(huán)AP2α 轉(zhuǎn) 化 酵 母AH109菌株及鑒定 用PEG／LiAc法將誘餌質(zhì)粒pGBKT7－h(huán)AP2α和構(gòu)建獵物質(zhì)粒載體pACT2轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，將轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞涂布于SD－Leu－Trp平板，30℃培養(yǎng)2－3d，將長(zhǎng)出的克隆連同陰陽對(duì)照一起接種于新的SD－Leu－Trp平板上，30℃維持生長(zhǎng)12h，復(fù)制至SD－Leu－Trp－His－Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板做自激活活性鑒定。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析誘餌質(zhì)粒pGBKT7－h(huán)AP2α蛋白表達(dá) 用醋酸鋰法將pGBKT7－AP2α轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109，在SD－Leu－Trp培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，挑取2－3mm大小的菌落過夜培養(yǎng)后，提取酵母蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western免疫印跡分析。由于酵母表達(dá)載體pGBKT7的多克隆位點(diǎn)帶有人Myc標(biāo)簽，我們所表達(dá)的融合蛋白亦帶有此標(biāo)簽，所以用抗人Myc單克隆抗體可與之產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時(shí)提取AH109空菌蛋白作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 hAP2α基因的擴(kuò)增

紫外分光光度計(jì)測(cè)定總mRNA濃為2.21μg／μl，A260／A280吸光度比值為1.87，說明總 mRNA濃度和純度均高，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后成功擴(kuò)增出目的基因hAP2α，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳可見擴(kuò)增產(chǎn)物位于1 300bp左右處，與目的基因大小相吻合（圖1）。

2.2 pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌載體構(gòu)建

將hAP2α基因與載體pGBKT7構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌提取質(zhì)粒，電泳鑒定，可見大小約8 600bp左右的pGBKT7－h(huán)AP2α連接產(chǎn)物（圖2），并且hAP2α測(cè)序正確（結(jié)果未顯示）；用SalI和EcoRI雙酶切后鑒定，可見1 300bp的hAP2α基因和7 300bp左右的pGBKT7（圖3），條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致，說明誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α構(gòu)建正確。

圖2 pGBKT7－h(huán)AP2α連接產(chǎn)物電泳

圖1 AP2α擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖3 重組質(zhì)粒pGBKT7－AP2α用SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定

2.3 誘餌蛋白自激活檢測(cè)

轉(zhuǎn)化pGBKT7－h(huán)AP2α重組質(zhì)粒的AH109感受態(tài)細(xì)胞能夠在SD－Leu－Trp選擇皿上生長(zhǎng)（圖4－B），不能在SD－Leu－Trp－His－Ade（圖4－C）選擇皿上生長(zhǎng)，而系統(tǒng)陽性對(duì)照轉(zhuǎn)化子可在SD－Leu－Trp－His－Ade選擇皿上生長(zhǎng)（圖4C）），證明沒有自身激活報(bào)告基因的活性，無需3AT抑制。所用的酵母菌株為Clontech系統(tǒng)的AH109，陽性對(duì)照PC為pGADT7－T＋ pGBKT7－53，陰 性 對(duì) 照 NC 為pGADT7－T＋pGBKT7－Lam。

2.4 蛋白質(zhì)印跡分析pGBKT7－h(huán)AP2α誘餌蛋白的表達(dá)

圖4 誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α自激活鑒定

提取未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒（對(duì)照組）與轉(zhuǎn)化了pGBKT7－h(huán)AP2α質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)組）的酵母蛋白質(zhì)，Western免疫印跡分析結(jié)果顯示：對(duì)照組無表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組可見明顯目的條帶且無雜帶，該融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小約52KD，條帶大小與預(yù)期結(jié)果相一致，說明該誘餌質(zhì)粒在AH109酵母細(xì)胞中能穩(wěn)定表達(dá)。

圖5 pGBKT7－h(huán)AP2α在酵母細(xì)胞表達(dá)的Western blotting結(jié)果

3 討論

hAP轉(zhuǎn)錄因子家族與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)，其中hAP－1轉(zhuǎn)錄因子在乳腺癌的形成、轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用［7］，而hAP－2α轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)則促進(jìn)HER－2癌基因的轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致乳腺癌。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制乳腺癌細(xì)胞中hAP－2α可引起細(xì)胞中HER2－mRNA及其蛋白的表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受抑制，提示hAP－2α基因在乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［8］，進(jìn)一步研究則發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中DEK蛋白促進(jìn)乳腺癌中hAP－2α對(duì) HER2轉(zhuǎn)錄作用［4］，DEK 這類自身不是轉(zhuǎn)錄因子，卻能與hAP－2α形成復(fù)合物并增強(qiáng)hAP－2α轉(zhuǎn)錄活性的蛋白叫做轉(zhuǎn)錄共激活因子［9］，具有協(xié)同hAP－2α參與乳腺癌的發(fā)生。因此，系統(tǒng)地鑒定hAP－2α結(jié)合蛋白并探討它們?cè)谌橄侔┌l(fā)病中的作用將有利于闡明hAP－2α的致癌機(jī)制，這些hAP－2α結(jié)合蛋白本身也可以成為潛在的腫瘤標(biāo)志物和藥物治療的靶點(diǎn)，對(duì)于乳腺癌的預(yù)防和治療將具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)將hAP2α基因克隆于含有Myc標(biāo)簽的pGBKT7載體中，正確構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7－h(huán)AP2α，Myc標(biāo)簽單克隆抗體所檢測(cè)融合蛋白大小與預(yù)期的hAP2α融合蛋白質(zhì)一致（圖5），說明hAP2α蛋白在酵母中表達(dá)成功，并且無自激活作用（圖4），誘餌載體pGBKT7－h(huán)AP2α的構(gòu)建不僅為下一步應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)尋找乳腺癌中未知hAP2α作用蛋白奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為尋找新的乳腺癌標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了研究方法。

［1］Thewes V，Orso F，J?ger R，et al.Interference with activator protein－2transcription factors leads to induction of apoptosis and an increase in chemo－and radiation－sensitivity in breast cancer cells［J］.BMC Cancer，2010，10（192）：1.

［2］Brand FX，Ravanel N，Gauchez AS，et al.Prospect for anti－h(huán)er2 receptor therapy in breast cancer［J］.Anticancer Res，2006，26（1B）：715.

［3］Li M，Wang Y，Hung MC，et al.Inefficient proteasomal－degradation pathway stabilizes AP－2alpha and activates HER－2／neu gene in breast cancer［J］.Int J Cancer，2006，118（4）：802.

［4］Pellikainen J，Naukkarinen A，Ropponen K，et al.Expression of HER2and its asso－ciation with AP－2in breast cancer［J］.Eur J Cancer，2004，40（10）：1485.

［5］黃前川，曹軍皓，季 蒙.癌基因DEK和轉(zhuǎn)錄因子AP－2α協(xié)同促進(jìn)乳腺癌中 HER2的高表達(dá)［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30（2）：175.

［6］Desmond G Powe，Gulfareen Akhtar，Hany o Habashy，et al.Investigating AP－2and YY1protein expression as a cause of high HER2gene transcription in breast cancers with discordant HER2 gene amplification［J］.Breast Cancer Research，2009，11（6）：1.

［7］殷詠梅，束永前，陳曉鋒，等.TNF－α通過JNK和 AP－1途徑調(diào)節(jié)乳腺癌MCF－7細(xì)胞VEGF的表達(dá)［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009，16（1）：12.

［8］黃前川，曹軍皓，丁進(jìn)亞.RNAi干擾 AP－2α對(duì)人乳腺癌細(xì)胞HER2表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響［J］.實(shí)用癌癥雜志，2009，24（4）：345.

［9］N??r AM，Lemon BD，Tjian R.Transcriptional coactivator complexes［J］.Annu Rev Biochem，2001，70（1）：475.