無機(jī)汞誘導(dǎo)人小細(xì)胞肺癌NCI＿H446細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

李 丹，于 蕾，袁海波，丁 會(huì)＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 呼吸科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)系）

本研究在發(fā)現(xiàn)有機(jī)汞具有多途徑抗癌效應(yīng)的基礎(chǔ)上［1，2］，進(jìn)一步探討無機(jī)汞對(duì)小細(xì)胞肺癌（SCLC）細(xì)胞系NCI－H446細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（NCI－H446）由吉林省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所贈(zèng)送。無機(jī)汞（IM）（德國，Merck公司），As2O3（美國，Alfar Aesar公司），順鉑（DDP）（山東齊魯藥廠）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（美國，Gibco公司）；TrizolRNA提取試劑盒（上海生物工程公司）；Taq DNA polymerase（大連寶生物工程公司）；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國，Sigma公司）；Rnasin RNA酶抑制劑（美國，Promega公司）；間隔100bp DNA分子量標(biāo)尺，Oligo dT寡核苷酸T（大連寶生物工程公司）。

1.2 主要儀器 550型酶標(biāo)儀，凝膠成像分析系統(tǒng)（美國，Bio－Rad公 司）；PCR 擴(kuò) 增 儀 （美 國，PE 公司）；FACSAN流式細(xì)胞儀（美國，BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長期 NCI－H446細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，配制成單細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106／ml，接種至6孔培養(yǎng)板（5×105／孔）。細(xì)胞分為IM組、As2O3組、DDP組和對(duì)照組。待細(xì)胞完全貼壁以后，IM組每孔加入終濃度為5.0μmol／L的IM，終體積均為2.0ml；As2O3組、DDP組和對(duì)照組分別加入As2O3、DDP及培養(yǎng)液，終體積為2.0 ml。培養(yǎng)6、12、24、48h后，分別收集細(xì)胞。

1.3.2 RT－PCR Trizol法提取細(xì)胞總RNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度良好后，RNA在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA。再以cDNA作為模板參與完成PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增的條件為：94℃1min，57℃1min，72℃90s，35個(gè)循環(huán)，最后1次循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min。根據(jù)基因cDNA序列設(shè)計(jì) Bcl－2、Bax、Caspase－3和β－actin的 PCR引物（由上海生物工程公司合成）。Bcl－2引物序列：正向5′CGCTCTGTGGATGACTGAGT3′，反向5′GATTTGACCATTTGCCTGAAT3′，產(chǎn) 物 長 度389bp。Bax引物序列：正向5′ATTGGAGATGAACTGGATAGC3′，反向5′CCACAAAGATGGTCACTG3′，產(chǎn)物長度337bp［3］。Caspase－3引物序 列：正 向 5′GCACTGGAAT－GTCAGCTCGCAA3′， 反 向 5′ GCCACCTTCCGGTTAACACGAC3，產(chǎn)物長度556bp［4］。β－actin引物序列：正向5′TCTGGATCACCTTCTGCTGG3′，反向5′ATTGCTCAGGA－CATTTCTG3′，產(chǎn) 物 長 度 690 bp［5］。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。目的基因的表達(dá)水平用其與GAPDH相比較的相對(duì)平均灰度值表示。

1.3.3 Western Blot NCI－H446細(xì)胞總蛋白的提取及定量 不同濃度（0、2.5、5、10及20μM）IM 處理NCI－H446細(xì)胞24h后，分別收集細(xì)胞，提取總蛋白。于595nm處測(cè)定光吸收值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)樣品濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)，經(jīng)膠片顯影，測(cè)積分光密度值，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化 不同濃度（1.25、2.5、5、10及20μM）IM、As2O3和DDP作用NCI－H446細(xì)胞24h后，隨著劑量的升高可以看到凋亡率有增加的趨勢(shì)，其中，IM組在濃度小于5.0μM時(shí)，早期凋亡率隨藥物濃度的增加而增高，于5.0μM達(dá)到峰值75.28%，IM的濃度超過5.0μM后，早期凋亡率隨藥物濃度的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而晚期凋亡和壞死率逐漸增多。As2O3和DDP也有同樣的規(guī)律，但其使細(xì)胞達(dá)到早期凋亡峰值的濃度是10.0μM，且早期凋亡率的峰值在As2O3組為56.87%，DDP組為61.20%，均低于IM（P＜0.001或0.01），其中DDP比 As2O3略高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表1－3及圖1。

表1 IM作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表1 IM作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001；▲P＜0.05；□P＜0.01

Late apoptosis Early apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）IM（μM）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 40.14±1.72＊ 0.69±0.03＊ 55.50±1.68 1.72±0.85 2.5 61.91±2.13＊ 3.85±1.12▲ 32.80±1.68 1.40±0.11 5.0 75.28±1.86＊ 3.79±0.92 19.34±1.13 2.08±0.45 10.0 51.46±2.37 30.84±2.25＊ 12.98±1.59 5.47±1.18▲20.0 18.57±1.06 34.96±1.60□ 1.49±2.26 44.96±2.16＊

表2 As2O3作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表2 As2O3作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001，▲P＜0.05，▽P＜0.01

As2O3（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 31.12±2.55＊ 2.52±0.13＊ 65.27±2.34 1.32±0.11▲2.5 42.14±1.14＊ 5.68±1.74 51.08±2.24 2.48±0.13▲5.0 44.98±1.99＊ 4.85±1.72 47.98±2.56 1.89±0.07 10.0 56.87±2.34＊ 8.64±1.21＊ 24.97±1.65 10.78±1.12＊20.0 31.02±1.16 35.13±2.45▽ 5.23±2.75 30.10±1.23＊

表3 DDP作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表3 DDP作用NCI－H44624h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001；▲P＜0.05

DDP（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 29.15±1.97＊ 2.62±1.02 67.32±2.56 21.25±1.62＊2.5 42.45±2.11＊ 5.16±2.34 48.47±2.21 4.79±1.83 5.0 48.78±2.67＊ 7.76±2.23 33.45±2.74 11.32±1.56▲10.0 61.20±2.21＊ 10.84±1.23 18.75±1.18 11.04±1.38 20.0 21.02±1.78 37.86±2.11＊ 3.16±0.09 38.27±1.69＊

圖1 IM、As2O3、DDP 作用 NCI－H446 24h后對(duì)早期細(xì)胞凋亡的影響

2.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 采用RT－PCR方法檢測(cè)5μM IM作用NCI－H446細(xì)胞6－48h后Bax mRNA水平的變化。結(jié)果顯示：IM組細(xì)胞Bax mRNA及Caspase－3mRNA水平高于對(duì)照組（P＜0.001），存在著時(shí)間依賴性增高趨勢(shì)，至24h達(dá)到最高；而Bcl－2mRNA水平低于對(duì)照組（P＜0.001），存在著時(shí)間依賴性降低趨勢(shì)，至24h達(dá)到最低。結(jié)果見表4。

表4 經(jīng)5μmol／L IM處理后不同時(shí)間點(diǎn)NCI－H446細(xì)胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 與 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

表4 經(jīng)5μmol／L IM處理后不同時(shí)間點(diǎn)NCI－H446細(xì)胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 與 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

＊P＜0.001vs control group

Time（h） Bax mRNA Bcl－2mRNA Caspase－3mRNA 0 0.55±0.010 1.40±0.024 0.47±0.025 6 0.85±0.028＊ 1.19±0.020＊ 0.66±0.035＊12 1.14±0.059＊ 1.10±0.018＊ 1.22±0.080＊24 1.66±0.030＊ 0.95±0.021＊ 1.42±0.025＊48 0.69±0.023＊ 0.91±0.014＊ 1.09±0.013＊

2.3 Western Blot法檢測(cè) Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白水平變化 采用Western Blot法檢測(cè)不同濃度（0、1.25、2.5、5及10μM）IM 作用 NCI－H446 24h后，細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl－2、凋亡促進(jìn)基因Bax、Caspase－3蛋白水平變化。結(jié)果顯示：IM各濃度組細(xì)胞Bcl－2蛋白水平均低于對(duì)照組，且存在著濃度依賴性降低趨勢(shì)；IM各濃度組細(xì)胞Bax蛋白水平均高于對(duì)照組，且存在著濃度依賴性增高趨勢(shì)；各組均可見32kDa的Caspase－3蛋白酶原表達(dá)，各實(shí)驗(yàn)組在17kDa處可見一裂解的小片段，并隨劑量的加大顏色逐漸加深，對(duì)照組未檢測(cè)到17kDa的小片段，表明在IM的作用下Caspase－3蛋白酶原被剪切活化。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇有開發(fā)潛力的IM作為研究對(duì)象，選擇療效肯定的順鉑（DDP）和同樣具有劇毒的三氧As2O3為對(duì)照，探討IM誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。結(jié)果表明，IM誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡與As2O3和DDP有同樣療效，且有較低使用濃度和高的早期凋亡率。理想抗癌藥就是以最小的劑量產(chǎn)生最大的療效，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡而不是壞死。因此IM具備這樣的條件，可能成為最有開發(fā)潛力的抗癌藥物之一。楊惠芬等［6］通過比較氯化汞（HgC12）和As2O3的誘導(dǎo)凋亡作用也證實(shí)，汞的誘導(dǎo)凋亡和殺死細(xì)胞能力強(qiáng)于砷。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)最早生產(chǎn)的癌靈1號(hào)（713注射液）以As2O3和HgC12為主要成份。1990年后，因?yàn)镠gC12不易溶于水，且測(cè)不出其濃度，所以不再加入制劑中。然而，去HgC12后，抗癌作用減弱。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜、精密的過程，在諸多調(diào)控凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，線粒體跨膜電位崩解是細(xì)胞凋亡特異性早期指標(biāo)之一，這是由于其通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore，PTP）開放引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換的直接后果。本研究檢測(cè)了調(diào)控PTP開放和關(guān)閉的兩個(gè)關(guān)鍵基因Bcl－2和Bax在mRNA及蛋白水平的變化，顯示IM組細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl－2mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，而凋亡促進(jìn)基因Bax mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組。說明IM在上述基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程中有重要調(diào)控作用。Bax相對(duì)量高于Bcl－2，Bax同二聚體的數(shù)量增多，促進(jìn)了PTP的開放，啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，加速了細(xì)胞凋亡［7］。此外，蛋白酶家族Caspase在凋亡程序的啟動(dòng)及執(zhí)行過程中發(fā)揮了非常重要的作用。故本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了最具代表性的 Caspase－3蛋白水平的變化，顯示IM 組Caspase－3mRNA水平高于對(duì)照組，說明IM在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了該基因的表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示隨著濃度的增加，凋亡的進(jìn)展，活性酶亞基P17的產(chǎn)生愈來愈多，說明IM可使翻譯后酶前體活化，即IM在雙重水平上調(diào)控了Caspase－3。當(dāng)濃度達(dá)到10μmol／L時(shí)，活性酶亞基P17卻呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)閴乃兰?xì)胞增加，使 Caspase－3的活性下降［8］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IM誘導(dǎo)NCI－H446細(xì)胞凋亡是通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。它下調(diào)Bcl－2表達(dá)、上調(diào)Bax表達(dá)，使得Bcl－2／Bax比例降低，使得PTP孔不可逆的開放，線粒體膜外的小分子可以進(jìn)入到膜內(nèi)，使線粒體膜電位消失，外膜破壞，經(jīng)系列反應(yīng)進(jìn)而活化Caspase－3，使其不能修復(fù)損傷的DNA，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，IM在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面與As2O3和DDP作用相同，但在同等劑量下，IM作用強(qiáng)于后兩者，如果結(jié)合它的揮發(fā)性，則將是吸入治療中心型肺癌的理想用藥，故IM可能成為最有開發(fā)潛力的抗癌藥物之一。

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