大鼠菌血癥模型的建立及其感染時(shí)對(duì)肝臟功能的影響

李京京，王 丹，吳 剛，趙永峰＊，馮瑞祥

（武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院1.影像科；2.檢驗(yàn)科，江蘇 南京210028）

菌血癥是常見(jiàn)的外科感染性并發(fā)癥，它可引起嚴(yán)重的SIRS和MODS，在臨床上具有很高的致死率［1，2］。導(dǎo)致菌血癥的原因有很多，例如創(chuàng)傷、術(shù)后感染、靜脈置管、腸道細(xì)菌移位等［3］。如何早期診斷感染的發(fā)生，是我們目前臨床面臨的重要問(wèn)題。盡管目前臨床上有諸多感染檢測(cè)指標(biāo)如體溫、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C－反應(yīng)蛋白、細(xì)胞因子（TNF－α、IL－6）等，但由于這些檢測(cè)指標(biāo)缺乏特異性，在很大程度上影響了對(duì)感染早期診斷的準(zhǔn)確性。因此，建立一種重復(fù)性好、簡(jiǎn)單可靠的菌血癥動(dòng)物模型，對(duì)我們研究細(xì)菌感染的發(fā)病機(jī)制以及篩選感染標(biāo)志物具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 菌株和動(dòng)物

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和大腸桿菌（Escherichia coli）由本室分離，源自大鼠腸道。SD大鼠，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌性，180－200g。

1.2 主要試劑

麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)XOID公司，PCT試劑盒購(gòu)自R＆D公司。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將－80℃保存的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌菌種接種于新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h。然后離心，用滅菌的PBS洗滌菌體2次，后用無(wú)菌的生理鹽水重懸菌體，并調(diào)整菌液濃度為（2－4）×1010CFU／ml。

1.4 菌血癥感染模型的制備

實(shí)驗(yàn)分組：SD大鼠64只，雌性，體重180－200 g，將其隨機(jī)分為3組：生理鹽水對(duì)照組（16只）；肺炎克雷伯菌感染組（24只），大腸桿菌感染組（24只）。將大鼠適應(yīng)1周后，開(kāi)始造模。在感染的第0天，對(duì)照組尾靜脈注射無(wú)菌生理鹽水（0.3ml／只），對(duì)于感染組，分別尾靜脈注射肺炎克雷伯菌和大腸桿菌菌液（0.3ml／只）。注射完成后，分別在感染的第4h、8h、24h、48h、72h、1w 時(shí)間點(diǎn)，各處死4只大鼠，無(wú)菌收集血液，用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿降鈣素原（Procalcitonin，PCT）檢測(cè)、血液生化以及血培養(yǎng)等分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，依不同情況進(jìn)行 Mann－Whitney U test和單因素方差分析，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果以中數(shù)（范圍）表示，其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 感染大鼠血液中白細(xì)胞的變化 血液中的白細(xì)胞（WBC）在感染和炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)有數(shù)量的變化，在臨床上被廣泛用來(lái)監(jiān)測(cè)感染的發(fā)生，本結(jié)果顯示，在大鼠感染后第4－8h時(shí)，白胞數(shù)量明顯降低，24－72h時(shí)開(kāi)始升至正常水平，而1周又顯著上升，呈現(xiàn)先低后高的趨勢(shì)，見(jiàn)表1。

表1 菌血癥大鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 感染大鼠血液中細(xì)菌數(shù)量的變化 本研究結(jié)果顯示，血液中的活菌數(shù)量在感染后第4－8h時(shí)，活菌數(shù)最高，可達(dá)到2×103CFU／ml。24－72h時(shí)細(xì)菌數(shù)量有所降低，而1周時(shí)，血液細(xì)菌培養(yǎng)已為陰性，見(jiàn)表2。

2.3 感染大鼠血漿PCT水平的變化 結(jié)果顯示，在大鼠感染細(xì)菌后4h時(shí)，其體內(nèi)血漿中的PCT開(kāi)始顯著增高（P＜0.01），8h－48h時(shí)，一直維持顯著增高水平（P＜0.01）。感染后72h時(shí)，PCT水平開(kāi)始降低。一周時(shí)，肺炎克雷伯菌感染組其PCT略有顯著差異，而大腸桿菌感染組，其PCT水平已降至正常，見(jiàn)表3。

2.4 感染大鼠血漿肝功能酶譜及蛋白的變化 結(jié)果顯示，在大鼠感染細(xì)菌后4h－8h時(shí)，其血漿中的ALT、AST開(kāi)始增高（P＜0.05），而到感染后期時(shí)，剛呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。GGT在感染細(xì)菌8h時(shí)，開(kāi)始增高，48h－1w時(shí)，顯著增高（P＜0.01），CHE則顯著降低（P＜0.01）。TP和 ALB在感染24h－72h時(shí)，一直維持顯著降低的水平（P＜0.01），至1w時(shí)，恢復(fù)至正常水平，見(jiàn)表4，5。

表2 菌血癥大鼠血液中細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果

表3 菌血癥大鼠血漿PCT水平

表4 大腸桿菌感染大鼠血漿生化指標(biāo)的變化

表5 肺炎克雷伯菌感染大鼠血漿生化指標(biāo)的變化

3 討論

肺炎克雷伯菌和大腸桿菌是臨床常見(jiàn)的血培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌，它是導(dǎo)致臨床菌血癥發(fā)生的主要菌種［4，5］。在本研究中，我們利用本室分離的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌通過(guò)尾靜脈感染的方式建立了大鼠的感染模型，研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠感染兩種細(xì)菌后，其精神狀態(tài)、血液生化和微生物等多項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生了顯著的變化，其發(fā)病過(guò)程符合菌血癥的病理特征，表明本模型建立可靠，為我們研究菌血癥提供了有效的感染模型。

在臨床上，血液中的白細(xì)胞數(shù)量通常被用來(lái)反應(yīng)感染的發(fā)生。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，大鼠在感染的急性期（4－8h），血液中的白細(xì)胞數(shù)量顯著降低，只有當(dāng)大鼠在感染后1周時(shí)才顯著升高。這可能是由于在感染的急性期，由于大量的細(xì)菌進(jìn)入血液中，機(jī)體為了迅速清除入侵的細(xì)菌，消耗了白細(xì)胞池中貯存的大量白細(xì)胞，造成了外周循環(huán)血液中白細(xì)胞數(shù)量的顯著降低。當(dāng)進(jìn)入感染后期時(shí)，機(jī)體補(bǔ)充了大量的白細(xì)胞，使得血液中的白細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)顯著增高的趨勢(shì)。由于大量的研究表明，創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等諸多因素均可造成血中白細(xì)胞數(shù)量的增高，所以白細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)于早期細(xì)菌感染預(yù)警缺乏較強(qiáng)的特異性。

降鈣素原（Procalcitonin，PCT）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的用于診斷全身性感染的標(biāo)志物，PCT是無(wú)激素活性的降鈣素（Calcitonin，CT）前肽物質(zhì)，是由116個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為13kD的糖蛋白。PCT在生理情況下，由甲狀腺的C細(xì)胞合成分泌。正常人血漿PCT水平很低，其值通常＜0.1ng／ml。而嚴(yán)重感染并有全身表現(xiàn)時(shí)，PCT水平明顯升高，有時(shí)可超過(guò)100ng／ml。這時(shí)PCT大部分由甲狀腺以外的實(shí)質(zhì)器官組織產(chǎn)生［6，7］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，大鼠在細(xì)菌感染后4h時(shí)，其血液中PCT的水平即發(fā)生顯著升高，并且在8h－48h時(shí)，一直維持顯著增高水平。ROC分析表明，PCT在細(xì)菌感染后8－48 h，較之其它標(biāo)志物（如CRP或白細(xì)胞數(shù)量等）具有較高特異性和準(zhǔn)確性。另外，大量的研究資料表明，PCT在病毒感染或自身免疫性疾病所致炎癥反應(yīng)時(shí)，其通常處于較低的水平，因此可以用來(lái)區(qū)分細(xì)菌和病毒所致的感染以及無(wú)菌性炎癥。但是，在局部存在感染時(shí)，PCT水平變化不顯著［8，9］。綜上，我們認(rèn)為PCT在細(xì)菌感染（尤其是菌血癥或敗血癥）早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

肝臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞（Kupffer細(xì)胞，KC），占全身單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的80%－90%，是機(jī)體防御細(xì)菌感染的一道重要防線。當(dāng)菌血癥發(fā)生時(shí)，進(jìn)入血液的細(xì)菌途經(jīng)肝臟，可被kupffer細(xì)胞清除。細(xì)菌的LPS被KC識(shí)別后，激活KC釋放大量的化學(xué)物質(zhì)（TNF、白介素B4和補(bǔ)體C5）和毒性介質(zhì)（血小板活化因子、NO 和內(nèi)皮素－1），可對(duì)肝臟造成損傷［10］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在感染發(fā)生時(shí)，ALT、AST、GGT等水平均顯著增高，而TP和ALB則呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。表明肝臟在清除細(xì)菌時(shí)，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)對(duì)其造成了一定的損傷。

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