大鼠視網膜干細胞轉染綠色熒光蛋白的實驗研究

王淑榮，王晨光，齊首楠，蘇冠方

（吉林大學第二醫院 眼科，吉林 長春130041）

體外實驗研究證明哺乳動物的視網膜干細胞（retinal stem cells，RSCs）具有自我更新的能力，并可被誘導分化成為多種類型的視網膜細胞，為治療眼科領域內的致盲性眼底疾病帶來了希望，在本實驗中，我們應用含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的質粒對RSC進行轉染，觀察細胞表達后的生長情況及分化情況，為將來進一步應用基因修飾的RSC進行基因治療及細胞治療的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 出生10d的Wistar大乳鼠（體重約45 g），由吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供。胎牛血清、DMEM／F12培養基、B27添加劑（Gibco），胰蛋白酶、G418、EDTA（Sigma），pGCsilencerTM U6／Neo／GFP（上海吉凱公司），BrdU、多聚賴氨酸，nestin、NSE、GFAP兔抗大鼠多克隆抗體，小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體，SABC、DAB試劑盒（武漢博士德公司），倒置相差顯微鏡（Olympus），CO2培養箱（SANYO）等。

1.2 方法

1.2.1 RSCs的分離、培養 斷頸處死Wistar大乳鼠（出生10d的），應用750ml／L乙醇消毒5min，取出眼球，在角膜緣后約3mm處環形剪開，分離取出睫狀體區組織，剪碎后應用含有0.5ml含有2.5 g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的消化液于37℃下消化15min，期間震蕩3次。應用含有100ml／L胎牛血清的DMEM／F12培養液終止消化，離心棄上清后應用無血清培養液洗滌最終制成單細胞懸液，調整細胞密度為109／L，于37℃、50ml／L CO2、飽和濕度條件下進行培養，并添加20μg／L大鼠堿性成纖維生長因子（bFGF），20μg／L大鼠表皮生長因子（EGF）及1×B27添加劑。大約3d時半量換液，當細胞團較大時予以傳代，傳代應用含有2.5g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的混合消化液消化細胞。

1.2.2 RSCs的鑒定 應用免疫細胞化學法進行鑒定。細胞爬片預先經多聚賴氨酸處理，檢測BrdU時需在固定細胞前1d向培養液中加入BrdU，調整其濃度為10μmol／L，爬片取出后PBS沖洗、40 g／L多聚甲醛室溫固定20min，PBS沖洗3次，每次5 min，2g／L triton X－100作用10min，0.1mol／L PBS洗3次，每次5min，300ml／L過氧化氫及純甲醇混合液（1∶50）室溫阻斷30min，蒸餾水洗2次，每次5 min。檢測BrdU的細胞爬片需用2NHCl 37℃孵育10min，BSA室溫封閉20min，傾去血清后加入nestin及BrdU一抗 （1∶200）4℃孵育過夜。用PBS代替一抗做空白對照，余步驟按照SABC試劑盒說明書操作，DAB發色后蘇木精復染、乙醇脫水、二甲苯透明、封片液封片后顯微鏡下觀察。

1.2.3 RSCs細胞轉染及篩選 實驗分為轉染組（轉染帶有綠色熒光蛋白的質粒），轉染試劑對照組（Lipofectamine 2000）。轉染前將細胞團制成單細胞懸液，調整濃度約4×105細胞／孔。應用24孔板參照轉染試劑說明書的技術參數進行細胞轉染。每2－3d更換一次含有G418的篩選培養基。最佳篩選濃度為在篩選7d內能夠殺死所有細胞的最小G418濃度。

1.2.4 GFP轉染后細胞分化及神經標志物鑒定轉染并篩選后的RSCs應用含50ml／L胎牛血清的DMEM／F12培養液進行誘導分化，觀察轉染后細胞分化情況，分化第7日應用前述的免疫細胞化學方法檢測NSE及GFAP的表達情況。

2 結果

2.1 RSCs的體外培養、鑒定

原代培養2d后可以觀察到呈懸浮生長的小球狀細胞團，折光性強（圖1）。細胞團數量在4－5d后逐漸增多，體積逐漸增大，至7－9d左右進行細胞傳代。傳代后48h即可形成新的與原代相似的細胞團，隨傳代次數增加細胞生長逐漸變緩。第2代RSCs細胞內可檢測到nestin、BrdU均呈現陽性的棕黃色染色，空白對照組未見染色（圖2、3）。

圖1 原代視網膜干細胞（×200）

圖2 第2代視網膜干細胞nestin免疫細胞化學染色陽性（×200）

圖3 第2代視網膜干細胞BrdU免疫細胞化學染色陽性（×200）

圖4 轉染GFP的視網膜干細胞（×200）

2.2 RSCs轉染與篩選

經過優化確定應用 DNA（μg）：轉染試劑（μl）1∶2.5比例進行細胞轉染，并確定應用150μg／ml為最佳G418篩選濃度對轉染后第2日的細胞進行篩選。轉染后大部分細胞形態比較接近于原始情況，未發生明顯變化，少部分細胞變為貼壁生長，還有少部分細胞逐漸死亡（圖4），各實驗組改變相似。更換篩選培養基后不帶有綠色熒光的干細胞逐漸死亡，帶有綠色熒光的細胞改變無明顯，細胞重新積聚成團狀生長，一周后存活的細胞基本均為帶有綠色熒光的細胞，不表達綠色熒光的RSCs基本已全部死亡（圖5）。

2.3 轉染后的RSCs的體外誘導分化

應用前述方法對轉染并已篩選后的RSCs進行誘導分化，誘導后大部分細胞變為貼壁生長，第3d時可見部分細胞出現小突起，隨著誘導分化時間的延長小突起不斷延伸，部分交織成網狀，分化7－10 d時可觀察到較多細胞具有神經細胞形態。GFP轉染組與轉染試劑對照組細胞分化情況相似，無明顯差別。應用免疫細胞化學方法分別檢測到兩組細胞分化后均不同程度表達NSE及GFAP（圖6－8）。

圖5 轉染并篩選一周后的RSCs均表達GFP（×200）

圖6 轉染并篩選后的RSCs可誘導分化為神經樣細胞（×400）

圖7 轉染并篩選的RSC誘導分化后細胞NSE免疫化學染色陽性（×400）

圖8 轉染并篩選的RSC誘導分化后細胞GFAP免疫化學染色陽性（×400）

3 討論

近年來一些研究認為，存在于哺乳動物胚胎視網膜內及成年哺乳動物的睫狀區［1－4］的干細胞或前體細胞具有一定的增殖能力，并可在體內外誘導條件下分化為多種視網膜細胞［5－6］，并且某些特定基因的修飾將改變RSCs的分化特性，Jomary C［7］等將外源性轉錄因子Crx基因導入到小鼠及人類睫狀區來源的RSCs，發現可促進RSCs分化出光敏感性光感受器細胞類型。Inoue等［8］將OTX2及CRX基因共同修飾的RSCs移植到小鼠眼內時，發現基因修飾的干細胞的視網膜整合能力和分化能力得到增強。因此，RSCs定向分化機理的探索將為致盲性眼病的細胞治療與基因治療方法研究奠定理論基礎。

本實驗通過體外分離、培養，在體外成功擴增出RSCs，具體表現為可自我更新的懸浮生長的細胞團，并且免疫細胞化學染色顯示體外擴增的細胞均表達神經干細胞標志物nestin，BrdU染色陽性提示細胞具有一定的體外增殖的能力。在完成RSCs的分離、培養及鑒定后，本實驗選取生長狀態較佳的第2代RSCs，經過優化DNA量與脂質體的比例后成功將帶有GFP的質粒導入到RSCs內，轉染后細胞內出現的綠色熒光提示轉染成功并表達外源性蛋白質，雖然通過轉染優化后轉染率約在20%左右，但經過轉染后的G418篩選，可有效的將未轉染外源性DNA的細胞清除，待轉染1w時，基本細胞均表達綠色熒光，提示經過G418篩選后可使RSCs得到有效的富集及純化。

轉染GFP后細胞的形態及生長特性無明顯改變，并且和對照組一致，在存在血清等誘導條件下，帶有綠色熒光的RSCs也可分化為具有神經細胞形態的細胞，并表達神經元標志物NSE及神經膠質細胞標志物GFAP，提示本實驗轉染含有GFP的外源性DNA后沒有對細胞的生長、增殖及分化等特性發生明顯影響。本實驗證明應用脂質體轉染法可成功將外源性基因導入到RSCs內并表達外源性蛋白質，為下一步將一些具有治療功能的基因或對干細胞定向分化具有重要意義的特定基因導入到細胞內進行表達的實驗研究奠定了理論基礎，并希望通過特定基因修飾改變干細胞的某些特性，為將闡明干細胞定向分化機理及應用特定基因修飾的干細胞進行細胞治療及基因治療提供了理論依據。

［1］Vincent T，Brenda LKC，Bernard JC，et al.Retinal stem cells in the adult mammalian eye［J］.Science，2000，287：2032.

［2］Yang P，Seiler MJ，Aramant RB，et al.In vitro isolation and expnsion of human retinal progenitor cells［J］.Exp Neurol，2002，177：326.

［3］Gu P，Harwood LJ，Zhang X，et al.Isolation of retinal progenitor and stem cells from the porcine eye［J］.Mol Vis，2007，13：1045.

［4］Jian Q，Xu H，Xie H，et al.Activation of retinal stem cells in the proliferating marginal region of RCS rats during development of retinitis pigmentosa［J］.Neurosci Lett，2009，465（1）：41.

［5］Canola K，Angénieux B，Tekaya M，et al.Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（1）：446.

［6］Mansergh FC，Vawda R，Millington－Ward S，et al.Loss of photo－receptor potential from retinal progenitor cell cultures，despite improvements in survival［J］.Exp Eye Res，2010，91（4）：500.

［7］Jomary C，Jones SE.Induction of functional photoreceptor phenotype by exogenous Crx expression in mouse retinal stem cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（1）：429.

［8］Inoue T，Coles BL，Dorval K，et al.Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells［J］.Stem Cells，2010，28（3）：489.