jck多囊腎小鼠腎囊泡上皮細胞MAPK信號通路上調

闞秀芳，趙麗晶，李 浩，李丁洋，邵 晨，謝愛國，趙麗娟＊

（1.長春市第二醫院 內科，吉林 長春130062；2.吉林大學基礎醫學院病理生理學系；3.沈陽軍區空軍招收飛行學員體檢隊）

常染色體顯性遺傳多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一種較常見的單基因遺傳性疾病，在人群中發病率高達1／1000－1／400，占我國終末期腎衰竭病因的第4位。ADPKD病變以雙腎多發性進行性囊泡為主要特征，繼發引起腎功能改變，終末期導致腎衰。ADPKD病程長，給病人和社會造成的經濟負擔較大。目前，除應用腎移植和透析治療終末期腎衰，尚無能夠阻止囊泡的發生和生長的有效藥物［1－2］。因此，針對ADPKD的發病機制，尋找預防或延緩ADPKD發病甚至逆轉其病程的新藥物是該領域的研究熱點。

我們的前期研究結果表明：8周齡jck小鼠腎臟顯著增大，出現多發、大小不一的腎囊泡。囊泡上皮細胞呈扁平狀，提示由于囊液過度分泌引起的囊內壓增加所致。jck腎囊泡上皮細胞表達AQP2、AQP3和AQP4，提示其腎囊泡上皮細胞來源于腎集合管，并具有腎集合管的功能特性［3］。

目前認為多囊腎病腎囊泡的發生和進展主要是三個病理過程共同作用的結果：腎小管上皮細胞過度增殖、囊泡內液體的積聚和細胞外基質的重構［4，5］。激活腺苷酸環化酶（AC）可以使細胞內cAMP增加，激活PKA，在生長因子和細胞內低鈣的共同作用下，通過激活 Raf－1／B－Raf－MEK－ERK通路，促進細胞增殖。但MAPK在jck多囊腎動物模型多囊腎囊泡發生發展中的作用尚未見報道。

本研究擬應用jck PKD小鼠模型，評價信號通路蛋白在jck小鼠腎囊泡上皮細胞的調控，確定jck PKD腎囊泡上皮細胞異常增殖過程中，細胞內信號轉導通路所起的作用，為研究腎囊泡生成和增大機制，探討抑制PKD囊泡增大的藥物作用靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos和β－actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Sigma公司，ECL Plus試劑盒購自Amersham公司。

1.2 動物模型 雜合子jck PKD小鼠模型購于Jackson Lab，潔凈級條件飼養，經雜合子相互交配獲得純合子小鼠。12周齡時稱體重，取雄性小鼠血進行血尿素測定，分離腎臟進行腎臟指數、腎臟組織學、蛋白表達調控分析。同窩雄性野生型小鼠作對照。

1.3 組織學觀察 將腎臟組織標本用10%甲醛固定后，石蠟包埋、切片，然后進行蘇木精伊紅（HE）染色。光學顯微鏡下觀察、照相。

1.4 Western blot 腎組織超聲勻漿30s，用Biorad蛋白定量試劑盒對樣品進行蛋白定量。配制12%SDS－PAGE凝膠，取20μg蛋白質樣品，加入等體積2×上樣緩沖液，100V恒壓電泳，采用Bio－Rad轉膜儀將蛋白樣品轉移至PVDF蛋白轉移膜上，再將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉60 min。TBS－T漂洗2次，加入1∶500倍稀釋的抗H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK、ERK、c－fos、和 β－actin多克隆抗體，4℃下反應過夜，TBS－T洗膜10 min×3次，加入1∶10 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育30min，TBS－T洗膜。ECL Plus試劑盒顯影。

2 結果

2.1 jck PKD小鼠表型 12周齡jck純合子小鼠體重明顯低于同窩野生型小鼠（圖1A），可見腹部明顯增大，活動受限。jck純合子小鼠的腎臟指數大于野生型小鼠腎臟4倍以上（P＜0.01，圖1B）。血尿素水平在jck純合子小鼠超過60mM，為野生型的7倍以上（P＜0.01，圖1C），提示已出現嚴重的腎功能損傷。

2.2 jck PKD小鼠腎臟組織形態 12周齡jck純合子小鼠腎臟組織表現多發、大小不一囊泡，囊泡上皮細胞呈扁平狀，腎囊泡占腎組織的90%以上（圖2A）。而同窩野生型小鼠腎臟則呈現正常腎組織結構（圖2B）。

2.3 MAPK信號通路蛋白在腎臟的表達調控Western Blot分析結果表明，jck腎臟表達的 HRas、p－Raf、p－MEK、pERK 和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調，表明囊泡上皮細胞表達的Raf、MEK、ERK在jck腎臟的磷酸化明顯高于其在野生型腎臟的表達水平，其可能是MAPK通路激活所致。見圖3。

圖1 jck小鼠表型

圖2 jck純合子小鼠腎臟異常

圖3 MAPK信號通路在多囊腎組織調控分析

3 討論

目前已經發現多個基因自發突變可引起小鼠PKD。這些PKD小鼠模型多為常染色體隱性遺傳，但其病理學特征類似人常染色體顯性遺傳PKD［6］，常被用作PKD模型研究PKD的發病機制和研發治療PKD候選藥物。小鼠常染色體隱性遺傳病（juvenile cystic kidney，jck）是一常用PKD小鼠模型［7，8］。jck純合子小鼠3天齡時出現腎囊泡，4－5周齡時發展成明顯多囊腎病，發病小鼠可存活4個多月。

大量的動物體內外實驗和來源于人ADPKD腎臟標本的研究結果均表明：cAMP介導的信號通路是調節腎小管上皮細胞表型變化（過度增殖）和囊液積聚的最主要信號通路。目前研究已發現Ras－BRaf－MEK－ERK信號通路在ADPKD的發病過程中起著重要的作用。在ADPKD上皮細胞中，高水平的細 胞 內 cAMP 通 過 促 進 Ras－B－Raf－MEK－ERK信號通路促進囊泡上皮細胞的增殖和生長。在ADPKD上皮細胞中，囊泡上皮細胞內Ca2＋水平降低，PI3K－AKT途徑對B－Raf的抑制作用減弱，導致EGF等生長因子主要通過 Ras－B－Raf－MEK－ERK信號通路，上調周期蛋白 Egr－l，c－myc，c－fos等細胞增殖相關基因的表達水平，促進囊泡上皮細胞的異常增殖［9］。我們的實驗結果表明jck小鼠腎臟囊泡上皮細胞 MAPK通路中的 H－Ras、p－Raf、p－MEK、pERK和c－fos蛋白水平與野生型腎臟相比明顯上調，表明Raf、MEK、ERK在jck腎臟囊泡上皮細胞顯著磷酸化。這些結果證實jck腎囊泡上皮細胞MAPK信號通路激活，提示其在多囊腎病發生、發展過程中起重要作用，MAPK信號通路有可能成為治療多囊腎病的候選藥物篩選的藥物靶點。

［1］張樹忠，胡以平，梅長林，等.Ⅱ型多囊腎致病基因PKD2突變的研究進展［J］.中華腎臟病雜志，2006，7：440.

［2］高晉生，楊寶學.常染色體顯性遺傳多囊腎病的治療研究進展［J］.中國藥理學通報，2009，25：141.

［3］闞秀芳，周 虹，楊寶學.水通道蛋白在多囊腎病小鼠腎囊泡上皮細胞的表達與調控［J］.中華腎臟病雜志，2010，26：39.

［4］Gabow PA.Polycystic kidney disease：clues to pathogenesis［J］.Kidney Int，1991，40：989.

［5］Yamaguchi T，Nagao S，Kasahara M，et al.Renal accumulation and excretion of cyclic adenosine monophosphate in a murine model of slowly progressive polycystic kidney disease［J］.Am J Kidney Dis，1997，20：703.

［6］Guay－Woodford LM.Murine models of polycystic kidney disease：molecular and therapeutic insights［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，285：F1034.

［7］Atala A，Freeman MR，Mandell J，et al.Juvenile cystic kidneys（jck）：a new mouse mutation which causes polycystic kidneys［J］.Kidney Int 1993，43：1081.

［8］Upadhya P，Birkenmeier EH，Birkenmeier CS，et al.Mutations in a NIMA－related kinase gene，Jck1，cause pleiotropic effects including aprogressive polycystic kidney disease in mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：217.

［9］Gao J，Zhou H，Lei T，et al.Curcumin inhibits renal cyst formation and enlargement in vitro by regulating intracellular signaling pathways［J］.European Journal of Pharmacology 2011，654：92.