趨化性細胞因子CCL3L1基因拷貝數與HIV－1易感性研究

徐 斌，石 英，惠 威，何佳麗，魏琳琳，王 征，陳德喜

（首都醫科大學附屬北京佑安醫院 肝病內分泌科，北京100069）

獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）簡稱艾滋病，是由 HIV（Human Immunodeficiency Virus）病毒引起的一種傳染性疾病。HIV病毒侵入人體后破壞機體的免疫系統，引起一系列嚴重疾病，病后無特效療法，病死率高。人類第17號染色體的16個基因組由兩對親緣關系很近的基因組構成，即CCL3L—CCL3L1和CCL4—CCL4L1。CCL3和CCL3L1蛋白93個氨基酸中有88個相同，這兩個蛋白均是CCR5受體的配體，在體外試驗中均可抑制 HIV－1病毒復制［1］。影響HIV－1易感性的宿主因素很多，人們由早期對HLAⅠ等位基因、CCR5和CCR2基因變異的關注，轉向CCR5結合細胞因子水平的不同。本研究探討CCL3L1基因拷貝數不同對HIV－1易感性的影響，有助于監測個體對HIV－1的易感性，對監測疫苗的有效性具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 健康人群 2005年5月至2006年10月間，北京佑安醫院血庫，采集97例健康獻血原的抗凝全血。其中男66例，女31例，平均年齡36±18歲。

1.2 HIV／AIDS患者 2005年5月至2006年10月間，北京佑安醫院門診或住院的HIV／AIDS患者81例，男性54例，女性27例，平均年齡37±1.2歲。所有患者均為血液傳播感染并未經高效抗逆轉錄病毒治療，病程平均6.2±0.3年。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 按QIAamp DNA Mini Kit基因組提取試劑盒說明書步驟進行。

1.3.2 實時定量PCR檢測CCL3L1基因拷貝數引物選擇：（1）CCL3L1引物：sense primer：5’－tctccacagcttcctaaccaaga 3’；antisense primer：5’－ctggacccactcctcactgg 3’。（2）管家基因β－globin引物：sense primer：5’－ggcaaccctaaggtgaaggc 3’；antisense：5－ggtgagccaggccatcacta 3’。

以上引物由寶生物公司合成。SYBR反應體系：5×SYBR Green 25μl，引物（25μmol／L）2.5 μl，dNTP（10mmol／L）4.0μl，Mg2＋4.0μl，cDNA1.0μl，Taq酶0.25μl，H2O 5μl，10×buffer 5.0μl。反應條件：92℃2min預變性，92℃30s變性，55℃30s退火，72℃30s延伸，35個循環，72℃7min。反應結束后，由電腦自動分析并計算結果。

1.3.3 HIV／AIDS患者血漿中 HIV RNA水平的定量檢測 采用bDNA法進行檢測。使用德國Bayer公司的System 340bDNA分析儀，試劑采用廠家配套試劑。

1.3.4 HIV／AIDS患者流式細胞儀檢測 CD4＋T細胞數量 采用BD公司FACS Calibur Flow Cytometry System，試劑采用BD公司試劑TriTEST CD4／CD8／CD3with TruCOUNT tubes，檢測分析軟件使用MultiSET自動軟件。

1.4 統計學分析

采用SPSS14.0統計軟件，以是否患HIV－1感染作為因變量，以CCL3L1基因拷貝數作為自變量經logistic回歸分析評估其與HIV－1易感性的關系。采用Speraman相關分析和cubic回歸分析，評估HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與病毒載量的相關性。采用直線回歸分析HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數和CD4＋T細胞計數。檢驗水準取α＝0.05，P＜0.05有顯著性差異。

2 結果

2.1 中國漢族健康人群和 HIV／AIDS患者CCL3L1拷貝數分布

中國漢族健康人群的CCL3L1基因拷貝數呈poisson分布，中位數為0.943329。百份位數25%和75%分別為0.395930和1.986504。見圖1。

圖1 漢族健康人群和HIV／AIDS患者CCL3L1拷貝數分布

2.2 CCL3L1基因拷貝數對HIV易感性的影響

以健康中國漢族人群CCL3L1基因拷貝數的中位數1為截斷值，應用Logist回歸分析。結果表明：－2對數似然值為221.965，Cox和Snell的R2為0123，Nagellerke的R2為0.164，Hosmer和 Lemeshow的擬合優度檢驗統計量Chi－square為10.563，df為8，p為0.228；Wald統計量：P 值為0.001＜0.05，OR為0.501，95%可信區間（0.33～0.761），自變量CCL3L1基因拷貝數入選，方程分類能力達57.90%。Logistic回歸的分類概率方程為：

根據該方程，中國漢族健康人群CCL3L1平均基因拷貝數為1，若個體CCL3L1基因拷貝數（X）高于漢族健康人群平均基因拷貝數，這意味著該人不易發生HIV－1感染，低于漢族健康人群平均拷貝數者有較高的易感性。

2.3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與病毒載量的相關性

應用Spearman相關分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與病毒載量呈負相關性（correlation coefficient＝－0.804，P＝0.000）。

應用曲線回歸分析：將病毒載量取Log值后，做曲線評估，應用cubic三次函數曲線模型R2＝0.639，P 值＝0.000，回歸方程：LogHIV RNA＝5.656－1.397 X－0.988 X2＋0.585 X3（X 代 表CCL3L1基因拷貝數）。見圖2、3。

2.4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與CD4＋T細胞計數的相關性

應用Spearman相關分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與CD4T細胞計數密切正相關（correlation coefficient＝－0.893，P＝0.000）。

應用直線回歸分析得到回歸方程：CD4＋T細胞數＝140.805＋423.063×CCL3L1拷貝數，R值0.869，P值0.000，得到相同結論。見圖4。

圖2 CCL3L1基因拷貝數和LogVL Cubic曲線圖

圖3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與病毒載量分布

圖4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷貝數與CD4T細胞計數分布

3 討論

CCL3L1又稱LD78β，是CD4＋T細胞的趨化因子，一種93氨基酸的小蛋白，是趨化因子受體CCR5的天然配體之一，CCR5是HIV－1R5株進入CD4＋T細胞的主要輔助受體［2］。

β－趨化因子受體CCR5可以在多種免疫細胞表面表達，包括T淋巴細胞和巨噬細胞，主要表達于記憶性T細胞。既往研究表明CCR5基因變異影響HIV－1的易感性，32堿基的缺失（△－32）如為純合子則對HIV－1不易感，如為雜合子則宿主的病毒載量很低而且疾病進展緩慢［3］。Townson等報道CCL3L1基因拷貝數高的個體，CCL3L1蛋白產物會更多，并推斷CCL3L1基因拷貝數目不同會影響HIV－1的易感性和疾病的進展［4］。Gonzalez及其同事在1999年研究也發現CCR5配體的水平不同也影響HIV－1的易感性和疾病進程，從此人們開始關注CCR5的配體研究，這些配體絕大部分都是細胞因子［5，6］。高拷貝量CCL3L1可以抑制 HIV感染和疾病進程的直接原因：游離細胞因子可引發炎癥反應，同時在空間結構上抑制HIVgp120與CCR5結合。CCL3L1可以影響CCR5的表達，隨著CCL3L1基因拷貝數的增加，CCL3LI蛋白激活粒細胞數目也會增加［7］。CCL3L1拷貝數與T細胞表達CCR5的量成反比關系，體外試驗表明，高拷貝CCL3L1作為CCR5調節信號，引起CCR5受體分子內陷，造成HIV－1的gp120蛋白不能與CCR5結合，從而不能進入宿主細胞［8］。

Bugeja等研究268名澳大利亞HIV－1感染者和260名未感染者，以發現他們所含有的細胞因子CCL3L1基因水平。研究結果表明，HIV－1未感染者中CCL3L1陰性率2.3%，CCL3L1水平的高低與 HIV－1 易 感 性 以 及 疾 病 進 程 無 相 關 性［9］。Gonzales等調查來自57個民族的1064名健康人的CCL3L1復制水平，同時檢測4308名HIV－1陽性非洲裔美國人、歐洲人、西班牙裔美國人中CCL3L1基因水平，以發現不同種族人群CCL3L1基因數目不同是否影響HIV－1易感性和疾病進程。低于同種族CCL3L1平均基因拷貝數者，對 HIV－1更易感，感染風險率達39%，感染后疾病進展到艾滋病期發生率增長26%。高于同種族CCL3L1平均基因拷貝數者，對HIV－1不易感，降低風險率4.5%－10.5%［10］。 本 研 究 發 現 中 國 漢 族 健 康 人 群 的CCL3L1基因拷貝數中位數為1，與歐美種族和非洲裔種族的CCL3L1不同，比他們的CCL3L1平均基因拷貝數都低。本研究檢測中國漢族健康人群97例和HIV／AIDS人群81例CCL3L1基因拷貝數，發現低于同種族CCL3L1平均基因拷貝數者，對HIV－1更易感，感染風險率達34.3%。初步探討CCL3L1基因拷貝數和病毒載量及CD4＋T細胞數的相關性發現，CCL3L1基因拷貝數和病毒載量呈負相關（P＝0.000），CCL3L1基因拷貝數和CD4＋T細胞數呈正相關（P＝0.000），為探討CCL3L1基因拷貝數對HIV／AIDS疾病進程的影響奠定基礎。

本研究采用SYBR Green實時定量PCR檢測CCL3L1基因拷貝數，實時熒光定量 PCR（Real time fluorescent quantitative PCR）是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，實時定量PCR能夠實時監測產物擴增，在對數線性擴增期能夠迅速、簡便地檢測PCR產物的擴增情況。本研究根據引物二聚體的CT值、產物及引物二聚體的熔解曲線分析和凝膠電泳對條件進行優化，確定了CCL3L1的最佳檢測體系。通過優化反應條件我們發現，將讀板溫度設定在低于T值2－4℃可以提高擴增產物的特異性。就CCL3L1而言，讀板溫度設定為75℃，低于Tm值溫度3℃，可以促使引物二聚體的雙鏈變性，釋放出結合的SYBR Green I，降低引物二聚體的熒光信號的同時，特異性擴增的PCR產物仍保持復性狀態，其數量直接反映于熒光強度，從而增加檢測的特異性。

當我們知道每個種族的平均CCL3L1平均拷貝數后，可以通過細胞因子CCL3L1基因拷貝數的不同，判斷個體HIV－1易感性和疾病進展程度。通過對病人易感性的檢測，可以幫助臨床醫生制訂針對個體的治療計劃。并且通過CCL3L1基因拷貝數的不同，可以判定每個個體對疫苗的應答率。這也意味著CCR5配體基因產物對于HIV－1感染個體具保護性，CCL3L1基因拷貝數高者對HIV－1感染者的保護性越大。這項研究揭示了CCL3L1基因拷貝數個體的不同影響著HIV－1的感染過程，CCL3L1基因產物與HIV－1易感性密切相關。

［1］Modi WS.CCL3L1and CCL4L1chemokine genes are located in a segmental duplication at chromosome 17q12［J］.Genomics，2004，83（4）：735.

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［9］Bugeja MJ，，Booth DR，Bennetts BH，et al.Analysis of the CCL3－L1gene for association with HIV－1susceptibility and disease progression［J］.AIDS，2004，（18）：1069.

［10］Mackay CR.CCL3L1dose and HIV－1susceptibility［J］.Trends Mol Med，2005，11（5）：203.