高效液相色譜－庫侖電化學法在維生素A、E聯合檢測中的應用

張曉紅，呼 競，華正德，關 磊

（哈爾濱市婦幼保健院，黑龍江 哈爾濱150070）

維生素A是脂溶性維生素，亦名視黃醇，是體內維持正常視覺、促進生長發育、維持上皮完整、維持正常免疫功能以及增強機體抗感染能力的重要物質。其缺乏會損害兒童免疫功能，增加兒童死亡率。維生素A缺乏病是WHO公認的四大營養缺乏病之一，發展中國家因維生素A缺乏引起干眼病而致盲的患者高達1000萬以上，目前仍是不發達國家中威脅人類健康、尤其是兒童的主要疾病。“世界兒童問題首腦會議”及“90年代中國兒童發展規劃綱要”，將消除維生素A缺乏作為2000年戰略目標之一。維生素E（Vitamin E）也是脂溶性維生素，又稱生育酚，是維持機體正常代謝和機能的必需維生素。生育酚能促進性激素分泌，使男性精子活力和數量增加；使女性雌性激素濃度增高，提高生育能力，預防流產，還可用于防治男性不育癥、在抗氧化、抗自由基、提高免疫功能、抗衰老、抗癌變等過程中發揮著重要作用，缺乏時會引起心、肝和肌肉退化以及不生育、習慣性流產、脫發、肌營養失調、中樞神經系統變化和貧血等。故及時了解血液中維生素A、E的含量對臨床預防、診斷、治療有重要意義。本文在以往工作基礎上，改良了檢測條件，建立了高效液相色譜－庫侖電化學同時檢測人血清中維生素A、E含量的方法，靈敏度高，準確性好，回收率和重復性好，操作簡便、快速、結果可靠。

1 材料和方法

1.1 原理 用乙醇沉淀蛋白質，用己烷萃取維生素A、E，殘留物用乙醇重新溶解，這些化合物用C18柱通過反相液相色譜法來分離，用庫侖陣列電化學來檢測。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 美國ESA的高效液相色譜－庫侖電化學檢測分析系統，542自動進樣器（含制冷）；582型泵兩臺（梯度泵）；控溫元件箱。

1.2.2 試劑 標準品由Sigma公司提供，利用無水乙醇等試劑配制成從低到高5個不同濃度的混合標液，標液中含有一定量的維生素A、E及內標物維生素A醋酸鹽。

1.2.3 色 譜 條 件 色 譜 柱：ESA MD－150C18 Column（150mm×3.0mm，3μm）。檢測電壓：各通道電壓（mv）：200、400、550、800。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品采集 采集受檢者靜脈血或末梢血（適用于3歲以下兒童），離心后提取100μl血漿或血清。1.3.2 對樣品進行前處理 將100μl血漿或血清，利用化學試劑沉淀蛋白后萃取維生素A、E，并用氮氣將移出物吹成干燥狀態，殘留物用100μl ETOH／BHA液重新溶解等待測定。

1.4 測定

1.4.1 標準曲線的制作 按上述條件，采用內標法，用4個標準溶液的峰面積繪制標準曲線。

1.4.2 樣品測定 取處理好的樣品10μl進樣，按上述條件進行分析，獲得圖譜，對照標準曲線進行定量。

1.5 質量控制 收集正常人20份血清（或血漿）足量，加入200μg／dl、1 000μg／dl的標準溶液，采用雙水平質控，取得有效數據作為質量控制使用。

2 結果

2.1 色譜圖 維生素A、E檢測的樣品圖見圖1。

2.2 線性范圍和檢出限 配置不同濃度維生素A、E標準溶液，按標準曲線步驟進行測定，根據3倍基線噪聲所對應的維生素濃度計算方法的最低檢出限。

2.2.1 線性檢測 對維生素A、E標液進行倍比稀釋，等體積進樣，以每種維生素濃度的峰面積作圖，測出最低檢測限及線性回歸方程。見表1。

2.3 標準溶液的穩定性 配置同一濃度的標準溶液，連續5天進行測定，以峰面積的相對標準偏差觀察維生素E、A標準溶液的穩定性，實驗結果見表2、表3。結果表明，不同濃度的維生素A、E標準溶液在－20℃比較穩定，建議每周進行一次標準溶液的配置。表1 樣品線性范圍和檢出限

圖1 維生素A、E檢測色譜圖結果

項目 線性范圍 （μg／L） 線性方程 相關系數 最低檢測限（μg／L）＋0.003051 0.9952 0.052 VA 0.068－200 Y＝0.003984 X VE 0.112－2000 Y＝0.001689 X＋0.0001761 0.9997 0.038

表2 VE標準溶液的穩定性

VE濃度（μg／L）VE檢測的峰面積（微庫侖：μC）第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 R SD（%）2000 3.79 3.74 3.69 3.66 3.61 1.90 4000 7.39 7.35 7.17 7.19 7.11 1.68 10000 17.0 16.7 16.3 16.5 15.9 2.52 20000 30.2 29.1 28.9 28.7 28.0 2.75

表3 VA標準溶液的穩定性

2.4 精密度實驗 對同一標準溶液連續測定7次，以峰面積的RSD觀察精密度，維生素E、A的RSD分別為1.91%、2.9%，實驗結果見表4。

表4 VE精密度實驗

2.5 回收實驗 取3份血清樣本，加入3個濃度水平的標準溶液，進行加標回收實驗（n＝3），維生素E、A平均回收率分別在90%－111%、93%－102%，結果見表5、表6。

表5 維生素E加標回收率結果

表6 維生素A加標回收率結果

3 方法應用

用本方法分別同時測定了6歲以下兒童血清／血漿維生素A、E樣品120份；孕婦血清／血漿維生素A、E樣品90份。

結果表明血清中兒童維生素A的檢測范圍為26－51μg／L，孕婦維生素 A的檢測范圍為34－56μg／L，孕婦與兒童的維生素A水平有顯著差異，P＜0.01；6歲以下兒童維生素E的檢測范圍為342－1410μg／L，孕婦維生素E的檢測范圍為375－1731 μg／L，孕婦與兒童的維生素E水平無顯著差異，P＞0.01。

4 討論

4.1 檢測器的選擇 該系統采用電化學檢測器，比二極管檢測器數值定性靈敏度高1000倍，穿透式電極，實現了樣品100%的反應，沒有信號損失。自動進樣器，可精確進樣最小至1μl，并含有樣品盤冷卻裝置，保證了熱穩定性差、易分解的維生素A、E在分析過程中無樣品損失。

4.2 高壓梯度泵的應用 通過連續不斷地調整A、B流動相的配比，改善分離條件，提高分離效果，縮短分析時間。

4.3 流動相的選擇 由于維生素A、E為脂溶性維生素，故本法選擇以甲醇為主的流動相洗脫液。流動相為甲醇、水、正丙醇、磷酸鹽緩沖溶液按比例配成。

4.4 流速的選擇 改變流速不僅可以改變保留時間，同時對靈敏度也有一定的影響。實驗證明，在0.8ml／min時，維生素A、E的峰面積達最大值。

4.5 色譜柱的選擇 鑒于HPLC法一般使用C8、C18柱，比較了C8、C18柱的分離效果，發現應用C18 3μm的柱子將維生素A、E很好地分離，且峰形好。

4.6 樣品的選擇 通過反復實驗論證了采集末梢血，同時檢測維生素A、E的目的。

4.6.1 樣品的前處理 實驗表明，連續2次加入450μl正己烷進行二次萃取可達到分析要求。萃取時，漩渦混勻的力度和時間應盡量一致，否則影響提取效率和精密度。

4.6.2 樣品的濃縮 用氮氣吹干萃取液時，氮氣流量應盡量小，以防待測物質的損失。溶解殘渣時加入的乙醇量應準確，否則影響待測物濃度。

4.7 暗室的應用 為了避免樣品見光分解，樣品處理過程需在暗處。

4.8 我院引進的高效液相色譜－庫侖電化學分析系統，其靈敏度高，準確性好，對維生素A、E分析結果表明，此檢測方法操作簡單、可靠；是目前維生素A、E檢測的最佳方法。

4.9 運用高效液相色譜－庫侖電化學分析系統開展維生素A、E的聯合檢測，達到了一次采血可同時準確分析體內維生素A、E的含量。末梢血的采用極大方便了兒童，有利于此項工作在廣大基層開展。改變目前濫用維生素制劑的現象，達到合理用藥的目的，極大的降低了由于維生素A、E缺乏或中毒引起相關疾病的治療費用。

［1］劉雪平.高效液相色譜－庫侖電化學檢測法對多種脂溶性維生素及營養物質的分析［J］.中國衛生檢驗雜志，2003，13（5）：597.

［2］鄭妹鳳.反相高效液相色譜法同時測定兒童血清中維生素A、E含量的研究［J］.安徽預防醫學雜志，2008，14（3）：110.

［3］李影林主編.中華醫學檢驗全書［M］.北京：人民衛生出版社，1997：157－162.

［4］李靜娜.二極管陳列反相高效液相色譜法測定人血清中維生素E含量［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18（2）：2.