環(huán)孢菌素A－納米乳促進豬脂肪組織來源干細胞的增殖

尹巧香 王 恒 裴志勇 趙玉生

環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA)是臨床廣泛應用的高效免疫抑制劑，主要用于臟器移植術后抗免疫排斥反應和免疫疾病的治療。最近，系列研究認為CsA能促進心臟祖細胞分化為心肌細胞，其促增殖作用使心肌細胞產量提高了數倍甚至數十倍。還有一些研究認為CsA能促進人類成纖維細胞、血管內皮細胞增殖［1～3］。基礎研究的結果令人鼓舞，無疑為心臟再生提供了可能使用的一種藥物治療。然而，CsA的治療可引起很多不良反應，包括肝腎功能損害，牙齦過度增殖等，毫無疑問又限制了CsA現階段在臨床的大規(guī)模使用。為此，我們借鑒腫瘤化療藥物納米制劑靶向遞藥的成功經驗，制備出負載環(huán)孢菌素A的納米乳(cyclosporine A－nanopaticals emulsion，CsA －NP)，由于通過修飾納米微粒的直徑和表面特性可控制藥物在體內的重新分布，因而可達到靶向、高效、低毒的獨特藥理作用。脂肪組織來源干細胞(adipose tissue－derived stem cells，ASCs)因其來源廣泛，取材方便，易于培養(yǎng)擴增，無倫理學困擾等優(yōu)勢，而成為目前最具有吸引力的干細胞來源之一［4］。

本項研究提取小型豬的腹股溝脂肪組織，誘導分離為原代ASCs，并傳代擴增后進行鑒定。同時明確CsA －NP能否促進ASCs增殖，提高ASCs產量和效能，為后續(xù)在體動物研究藥物的應用提供依據。

材料與方法

1．實驗動物:廣西巴馬小型豬，雌雄不限，4～6個月齡，體重20～30kg，購自東北農業(yè)大學－中國農科院哈爾濱分院，由解放軍總醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)。所有動物研究全部符合國家《實驗動物管理條例》和《北京市實驗動物管理條例細則》。實驗經解放軍總醫(yī)院動物中心登記、許可。

2．小型豬脂肪組織來源干細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定:小型豬麻醉后，取腹股溝皮下脂肪組織5～8g，沖洗、去除血污和組織碎片，剪碎至糊狀，加入終濃度為0．1%的消化液20ml［1%Ⅰ膠原蛋白酶1．5ml(Gibco公司，美國)+1%Dispase酶1.5ml+0．25%胰酶6ml+無血清 L－DMEM培養(yǎng)液11m l］。置于37℃水浴震蕩消化1h，然后加入等量的含10%胎牛血清(10%FBSGibco公司，美國)的L－DMEM培養(yǎng)基終止消化。過濾;水平離心機800r/min離心5min;加入含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/m l鏈霉素的L－DMEM培養(yǎng)基重懸細胞;置入37℃、飽和濕度5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液去除未貼壁細胞。此后2～3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，至細胞達到80% ～90%融合時傳代。傳代時，加入0．25% 胰蛋白酶和0．02%EDTA 2m l，倒置相差顯微鏡見大部分細胞胞質回縮、形態(tài)變圓后立即加入2ml含10%FBS低糖 －DMEM培養(yǎng)液中止消化;1000r/min離心10min，棄上清液后加入少量含10%FBS低糖－DMEM培養(yǎng)液重懸，以1傳3的比例接種于新的培養(yǎng)皿內。待細胞達到近融合狀態(tài)時便可再次傳代。

3．小型豬脂肪組織來源干細胞的鑒定:取生長狀態(tài)良好的第3～4代細胞，用0．25%胰蛋白酶溶液消化后離心，沉淀重懸于PBS中，細胞密度調整為1×106m l。分別加入以下抗體:CD29 － FITC、CD31 － PE、CD34、CD44 － FITC、CD45、CD90－FITC、CD105－FITC和 HLA－DR－FITC。對照管加入PBS，CD34、CD45兩個管加入相應的FITC二抗，流式細胞儀檢測，記錄標本的陽性細胞百分率。Cell Quest軟件進行數據分析。

4．CsA－NP對ASCs增殖的影響:取生長狀態(tài)良好的第3～4代細胞，用0．25%胰蛋白酶溶液消化后計數，按細胞密度為1．2×104ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每板均分為7組，分組如下所示。其中0組作為空白對照組，每組均重復5孔，每組加100μl細胞懸液，實驗組外周1圈加入100μl的 PBS，于37℃，飽和濕度5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄上清，分別加入含 0、0．01、0．1、0．5、1、5μmol/L CsA － NP(由軍事醫(yī)學科學院藥物與毒物研究所制備、鑒定)的培養(yǎng)基(含10%FBS)200μl，繼續(xù)孵育1～7天，且每個時間點均設立對照組。于培養(yǎng)終止前4h，每孔加入MTT液(5mg/ml，美國 Sigma公司)20μl，置于37℃ 、5%的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h后，酶標儀測定各孔OD450值。各組OD450值分別減去空白對照組OD450值作為縱坐標，以時間(h)為橫坐標，繪制生長曲線。

0組:L－DMEM+10%FBS;1組:L－DMEM+10%FBS+ASCs;2組:L－DMEM+10%FBS+ASCs+0．01μmol/L CsA －NP;3組:L －DMEM+10%FBS+ASCs+0．1μmol/L CsA －NP;4組:L －DMEM+10%FBS+ASCs+0．5μmol/L CsA －NP;5組:L－DMEM+10%FBS+ASCs+1μmol/L CsA －NP;6組:L－DMEM+10%FBS+ASCs+5μmol/L CsA－NP。

5．統(tǒng)計學方法:所有數據應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，多組間均數比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．脂肪組織來源干細胞(ASCs)形態(tài)的觀察:ASCs原代細胞接種24h內貼壁，其中混有大量不貼壁的紅細胞及脂肪油滴，24h后首次換液，去除絕大部分不貼壁細胞(圖1A);原代細胞1周可達80%融合，繼續(xù)1∶3傳代培養(yǎng)。傳代后細胞生長迅速，5天左右可達單層細胞融合80% ～90%，傳代后細胞呈長梭形，纖維細胞樣形態(tài)，核居中，有1～2個核仁，細胞融合80% ～90%后可繼續(xù)多次傳代，形態(tài)變化不大，見圖1B。第3代傳代細胞呈旋渦狀生長(圖1B)。

圖1 脂肪組織來源干細胞

2．流式細胞儀檢測ASCs表面標志物:經流式細胞儀檢測(圖2)，其結果如下:CD29(99．06±0.30)%、CD44(98．20 ±0．30)%、CD90(97．40 ±0．40)%、CD105(98．30 ±0．44)%、CD31(2．06 ±0．06)%、CD34(2．34 ±0．33)%、CD45(1．98 ± 0．08)%、HLA － DR(1．66 ±0.08)%。檢測結果提示 ASCs分子表型 CD29、CD44、CD90、CD105 均呈陽性表達，而 CD31、CD34、CD45、HLA－DR均呈陰性表達，通過對ASCs細胞表面標志物的測定，證實ASCs細胞具有間充質干細胞的生物學特性。

3．CsA－NP對ASCs增殖的影響:關于CsA－NP對ASCs增殖的影響(圖3)，與不同濃度的CsA－NP對ASCs作用時間相關。總之，與對照組比較，CsANP濃度在(0．01～1．00μmol/L)之間，時間多數在3天以內對細胞增殖有明顯促進作用(P＜0．01);其中又以0．5μmol/L的CsA－NP劑量組為最佳，甚至在第5天都對細胞增殖有促進作用。而5μmol/L的CsA－NP劑量組對細胞增殖分化甚至有抑制作用。

討 論

圖2 流式細胞儀檢測ASCs分子表型

圖3 不同濃度CsA－NP、不同時間對ASCs增殖的影響A．0μmol/L;B．0．01μmol/L;C．0．1μmol/L;D．0．05μmol/L;E．1μmol/L;F．5μmol/L

本項研究表明，CsA－NP在低劑量(0．01～1.00μmol/L)、短時間(1～3天)促進 ASCs細胞增殖，呈現明顯劑量－效應和時間－效應。CsA是臨床上廣泛應用的高效免疫抑制劑，近年來，研究表明CsA能促進細胞增殖。Yan等［1］給大鼠的胚胎干細胞添加CsA(1～3μg/ml)獲得了10～20倍心臟祖細胞的倍增效果，1個胚胎干細胞最后可誘導分化為200個心肌細胞，分化的心肌細胞成功移植到大鼠心肌梗死模型中，修復了心肌梗死瘢痕，恢復了左室功能。隨后，該研究團隊又用人類多潛能干細胞心臟祖細胞誘導、擴增為心肌細胞，添加CSA(1～3μg/ml)組比對照組細胞數量增加了4．3倍，且這種心肌細胞幾乎完全具備人類心肌細胞特征［2］。還有研究表明，CSA促進人類牙齦細胞、成纖維細胞增生同樣呈現劑量 － 效應和時間 － 效應［3，4］。由此推論，CSA 能極大增強心肌細胞產量，無論在動物心肌細胞還是人類心肌細胞均獲得了成功。此技術無疑為獲得大量人類心肌細胞提供了可能的捷徑。雖然目前對CSA的誘導分化潛能、促進細胞增殖機制仍不清楚，但有研究表明，CSA的這種促進細胞增殖作用機制完全不同于免疫抑制作用。同樣是該研究小組又嘗試了另外的鈣調磷酸酶免疫抑制劑FK506和NF－AT nuclear factor of activated T cells(NFAT)制劑 11RVIVIT，卻并未達與CSA同樣促增殖效果，提示CSA的誘導分化細胞潛能并不是通過免疫抑制途徑實現的［1］。有趣的是，最近的臨床研究證實CSA能阻止心臟的缺血－再灌注損傷，比較一致的觀點認為是CSA通過與線粒體基質的環(huán)孢菌素受體(cyclophilin D，CyP－D)特異性結合，而阻止線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放，從而抑制心肌細胞的凋亡［5，6］。雖然不清楚CSA促增殖和抗凋亡作用是否有內在聯(lián)系，但基礎研究為臨床心臟再生提供了可能使用的一種藥物，添加CSA可能提高心肌細胞的產量和效能。而CsA－NP作為納米制劑，具有靶向、低毒、高效等優(yōu)勢，有理由相信對ASCs細胞增殖的影響將優(yōu)于CsA。

本項研究檢測結果提示ASCs分子表型CD29、CD44、CD90、CD105 均呈陽性表達，而 CD31、CD34、CD45、HLA－DR均呈陰性表達，證實本項研究培養(yǎng)的ASCs細胞具有間充質干細胞的生物學特性，與公認的ASCs細胞表面標志物相一致。總之，ASCs由于脂肪組織來源廣泛，取材方便，可獲得的基質細胞數量大，易于培養(yǎng)擴增，又具有細胞產量高、衰減速度慢、無免疫原性，無倫理學困擾等優(yōu)勢，成為最具吸引力的干細胞來源之一［7，8］。

1 Yan P，Nagasawa A，UosakiH，etal．Cyclosporin－A potently induces highly cardiogenic progenitors from embryonic stem cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，379(1):115 －120

2 Masataka F，Peishi Y，Tomomi O，et al．Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with cyclosporin － A［J］．PLoSONE，2011，2(22):1 －10

3 Andrukhov O，Matejka M，Rausch FX．Effectof cyclosporin A on proliferation and differentiation of human periodontal ligament cells［J］．Acta Odontologica Scandinavica，2010，68(6):329 －334

4 Cotrim P，Martelli－ Junior H，Graner E，et al．Cyclosporin A induces proliferation in human gingival fibroblasts via induction of transforming growth factor－ beta1［J］．JPeriodontol，2003，74(11):1625 － 1633

5 Gomez L，Thibault H，Gharib A，etal．Inhibition ofmitochondrial permeability transitionimproves functional recovery and reduces mortality following acute myocardial infarction in mice［J］．Heart Circ Physiol，2007，293(3):H1654 －H1661

6 Piot C，Croisille P，Staat P，et al．Effect of cyclosporine on reperfusion injury in acutemyocardial infarction［J］．N Engl JMed，2008，359(5):473－481

7 Poglio S，De Toni－ Costes F，Arnaud E，et al．Adipose tissue as adedicated reservoir of functionalmast cell progenitors［J］．Stem Cells，2010，28(11):2065 －2072

8 Shi CZ，Zhang XP，Lv ZW，et al．Adipose tissue－derived stem cells embedded with eNOS restore cardiac function in acute myocardial infarction model［J］．Int JCardiol，2012，154(1):2 － 8