吡格列酮和高脂喂養(yǎng)對(duì)SD大鼠SIRT6表達(dá)的影響

章建梅 徐 淼 韓俊峰 陸俊茜 劉若冰 魏 麗 賈偉平

SIRT6由Fyre1999年發(fā)現(xiàn)，是一種在哺乳動(dòng)物的多個(gè)組織中廣泛表達(dá)的細(xì)胞因子，為組蛋白H3K9去乙酰化酶和ADP－核糖基轉(zhuǎn)移酶，具有抗衰老、抑制炎癥等作用［1～4］。新近的研究發(fā)現(xiàn)其與糖脂代謝密切相關(guān)，而對(duì)其的調(diào)控研究卻知之甚少。關(guān)于糖脂代謝異常是否會(huì)引起SIRT6表達(dá)的改變及治療糖脂代謝異常的藥物又是否影響SIRT6目前研究較少。本研究擬通過高脂喂養(yǎng)建立肥胖SD大鼠模型并用吡格列酮干預(yù)來(lái)觀察SIRT6表達(dá)的改變，觀察高脂和PPAR－γ激動(dòng)劑對(duì)SIRT6表達(dá)的影響，為深入了解SIRT6的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

材料與方法

1．動(dòng)物模型的建立及分組:8周齡、體重約200g雄性清潔級(jí)SD大鼠(上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)24只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為:普通對(duì)照組(NC)8只，高脂組16只。每周記錄體重、攝食量和飲水量。NC組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料。普通飼料總熱量為380kJ/100g，其中糖類占55%，脂肪占24%，蛋白質(zhì)占21%。高脂飼料總熱量為520kJ/100g，其中糖類占20%，脂肪占59%，蛋白質(zhì)占21%。高脂組喂養(yǎng)8周后，再隨機(jī)分為兩組:高脂飲食組(HF)和吡格列酮(日本武田公司)治療組(FP)，每組8只。FP組予吡格列酮20mg/(kg·d)灌胃，NC組和HF組相應(yīng)予溶劑灌胃，灌胃 4 周［5］。

2．標(biāo)本收集及處理:12周后處死大鼠，死前靜脈采血，收集血清，－80℃保存待測(cè)。摘取附睪周圍脂肪、肝臟以及肌肉組織，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．大鼠血脂、血糖的測(cè)定:大鼠禁食12h后空腹血糖由強(qiáng)生血糖儀測(cè)尾尖血兩次取平均值獲得，空腹胰島素采用酶聯(lián)免疫法(mercodia公司)。Glamour 2000全自動(dòng)檢測(cè)分析儀測(cè)定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)。

4．RT－PCR:Trizol(Invitrogen公司)法提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Epicentre公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。根據(jù)SIRT6和管家基因18S的基因序列，設(shè)定上、下游引物。SIRT6:上游引物5'－gccgtctggtcattgtca－3'，下游引物 5'－agccttgggtgctactgg－3'(191bp);18S:上游引物 5'－ gtaacccgttgaaccccatt－3'，下游引物5'－ccatccaatcggtagtagcg－3'(151bp)。SIRT6的反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min，95℃ 變性 30s，56℃ 退火 30s，72℃ 延伸40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。18S的反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 5min，95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 40s，30 個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析鑒定，凝膠成像后結(jié)果應(yīng)用灰度掃描儀分析SIRT6與對(duì)應(yīng)的18S條帶灰度的比值表示SIRT6的相對(duì)表達(dá)量。

5．Western blot:用RIPA裂解液提取組織蛋白，取80μg蛋白質(zhì)樣品上樣，電泳及轉(zhuǎn)膜。膜與SIRT6抗體(abcam公司)1∶1000、β －actin 抗體1∶800、ERK 抗體1∶1000，4℃過夜。Ⅱ抗(1∶2500)室溫下與膜進(jìn)行雜交1h。ECL顯色，攝取圖像。應(yīng)用灰度掃描儀分析SIRT6與對(duì)應(yīng)的β－actin/erk條帶灰度的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用配對(duì)t檢驗(yàn)及單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．各組大鼠體脂和血脂譜差異:12周后，HF組大鼠體重、FINS、FBG、TC、TG 和 LDL－C 均明顯高于NC組(P均＜0.05)，HDL－C較NC組明顯下降(P＜0.01)。與HF組相比，F(xiàn)P組大鼠體重、FINS、FBG、TC、TG、LDL－C均下降，差異有顯著性(P均＜0.05，表1)。

2．高脂和吡格列酮對(duì)SIRT6表達(dá)的影響:SIRT6在大鼠附睪脂肪、肝臟及肌肉組織均有表達(dá)。與NC組相比，HF組大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6蛋白及mRNA輕度下降。而吡格列酮治療后，大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6 mRNA與HF組相比分別上升1．51倍、2．07倍、1．72倍(P ＜0．05);大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6蛋白與HF組相比分別上升1．44倍、1．89倍、1．33倍(P ＜0．05，圖1、圖2)。

表1 各組間大鼠體重和血生化指標(biāo)的比較(x±s)

討 論

肥胖是體內(nèi)脂肪，尤其是甘油三酯積聚過多而導(dǎo)致的一種狀態(tài)，肥胖者的細(xì)胞肥大且數(shù)量增多，可導(dǎo)致某些激素的表達(dá)增強(qiáng)或減弱，從不同層次影響糖脂代謝，形成糖脂代謝紊亂。SIRT6是一種由355個(gè)氨基酸殘基組成的核蛋白，基因定位于19p13．3，它跨越了8427bp的區(qū)域，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成［1］。Mostoslavsky等［2］發(fā)現(xiàn) SIRT6 基因缺陷小鼠產(chǎn)后四周表現(xiàn)為皮下脂肪減少、低血IGF－1及致死性血糖。Zhong等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6敲除使得糖酵解關(guān)鍵酶啟動(dòng)子上組蛋白乙酰化，使DNA與組蛋白結(jié)合松弛，從而促進(jìn)這些酶轉(zhuǎn)錄活性增加，使血糖進(jìn)入外周組織細(xì)胞參與糖酵解，引起血糖降低。Kim等［4］觀察到，肝臟特異性SIRT6敲除的小鼠脂肪合成增加而氧化減少，最終小鼠發(fā)展為脂肪肝。另一方面Kanfi等［5］也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT6可抑制高脂飲食引起的肥胖，提示SIRT6參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)。目前對(duì)SIRT6的表達(dá)調(diào)控方面的研究較少。我們知道SIRT6對(duì)糖脂代謝有著重要的作用，而吡格列酮是治療糖脂代謝異常的常用藥物。吡格列酮為PPAR－γ激動(dòng)劑，通過激動(dòng)PPAR－γ對(duì)許多基因起著調(diào)控作用。因此我們觀察了高脂和PPAR－γ對(duì)SIRT6表達(dá)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)高脂飼喂后大鼠的體重、FINS、FBG、TC、TG和LDL－C均明顯升高(P ＜0．05)，HDL－C則明顯下降，而吡格列酮干預(yù)后大鼠的體重、FINS、FBG、TC、TG和LDL－C均下降，差異有顯著性(P＜0．05)。提示吡格列酮除具有明顯降糖作用外，還具有明顯的調(diào)脂作用。

研究顯示熱量限制或禁食后SIRT6表達(dá)明顯升高，但高脂對(duì)SIRT6表達(dá)的影響尚有爭(zhēng)議:如有研究顯示高脂飲食大鼠SIRT6蛋白輕度降低;而Palmer等［6］卻發(fā)現(xiàn)高脂飲食小鼠SIRT6蛋白明顯下降(P＜0．05)。本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)后，雖然大鼠附睪脂肪、肝臟及肌肉組織中SIRT6蛋白和mRNA表達(dá)有所下降，但沒有顯著性差異，推測(cè)高脂對(duì)SIRT6的影響可能存在種屬間差異。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPAR－γ可以上調(diào)大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6 mRNA和蛋白的表達(dá)。PPAR－γ激動(dòng)劑吡格列酮治療后，大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6 mRNA與HF組相比分別上升1.51倍、2.07倍、1.72倍(P＜0.05)。而大鼠附睪脂肪、肝臟、肌肉組織中的SIRT6蛋白與 HF組相比分別上升1．44倍、1．89倍、1．33倍(P＜0．05)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)吡格列酮可從mRNA及蛋白水平影響SIRT6的表達(dá)，推測(cè)吡格列酮的降糖、調(diào)脂作用可能經(jīng)由上調(diào)SIRT6的表達(dá)來(lái)起作用的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)吡格列酮治療后肝臟組織SIRT6 mRNA及蛋白上升最顯著，推測(cè)吡格列酮主要上調(diào)肝臟SIRT6影響肝臟糖脂代謝從而起著降糖調(diào)脂的作用。Yang等［7］的實(shí)驗(yàn)也顯示羅格列酮可改善肝纖維化，促進(jìn)OLETF小鼠肝臟SIRT6表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。Kim等［4］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示肝臟特異性SIRT6敲除的小鼠最終小鼠發(fā)展為脂肪肝。

總之，本研究通過對(duì)高脂喂養(yǎng)及吡格列酮干預(yù)后大鼠各組織SIRT6表達(dá)水平的觀察，發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)降低SIRT6的表達(dá)，而吡格列酮治療后可逆轉(zhuǎn)SIRT6的表達(dá)，且血糖血脂明顯改善，推測(cè)吡格列酮通過激動(dòng)PPARγ上調(diào) SIRT6的表達(dá)從而影響糖脂代謝，但PPARγ對(duì)SIRT6的具體調(diào)控機(jī)制還有待細(xì)胞水平的進(jìn)一步分析。

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3 Zhong L，D'Urso A，Toiber D，et al．The histone deacetylase Sirt6 regulates glucose homeostasis via Hif1alpha［J］．Cell，2010，140(2):280－293

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6 Palmer NO，F(xiàn)ullston T，Mitchell M，et al．SIRT6 inmouse spermatogenesis ismodulated by diet－ induced obesity［J］．Reprod Fertil Dev，2011，23(7):929－939

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