鹽酸13－己基小檗堿對T淋巴細(xì)胞活化和角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

宋莎莎 李新宇 王永芳 徐蘭芳 唐美育 鄭家潤

濕疹、皮炎及銀屑病等一類炎癥相關(guān)性皮膚病是皮膚科常見病。該類疾病通常由活化的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫紊亂引起，多種免疫細(xì)胞及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞共同參與發(fā)病過程［1］。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞不僅是浸潤的T淋巴細(xì)胞免疫攻擊的靶細(xì)胞，而且是皮膚免疫反應(yīng)中的積極參與者。角質(zhì)形成細(xì)胞在靜息狀態(tài)其免疫－炎癥介質(zhì)呈低表達(dá)狀，一旦受到來自活化T細(xì)胞表達(dá)的TNF－α、IFN－γ等細(xì)胞因子或致炎信號刺激，它能表達(dá)過量的炎癥介質(zhì)如IL－8和TNF－α等［2］。此外，疾病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞表達(dá)的IL－1等趨化因子也是強有力的致炎因子。細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)是導(dǎo)致炎癥性皮膚病免疫病理損傷的重要因素，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞引起或使之持續(xù)的炎癥事件是重要的治療手段。

小檗堿為毛莨科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，是傳統(tǒng)抗菌藥，并有抗炎等生物活性。鹽酸13－己基小檗堿是鹽酸小檗堿的衍生物。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，該化合物具有較強的抗炎、抗菌和抗皰疹病毒等活性［3，4］。為了探索該化合物針對炎癥性皮膚病的抗炎作用靶點，為進(jìn)一步研發(fā)提供實驗依據(jù)，本研究以體外培養(yǎng)的永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞、小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞為靶細(xì)胞，在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)體系中探討鹽酸13－己基小檗堿對T淋巴細(xì)胞活化，以及IL－8、TNF－α和IL－1β產(chǎn)生的影響，同時與他克莫司、雷公藤內(nèi)酯醇和丙酸氯倍他索做對照研究。

材料與方法

1．材料:(1)細(xì)胞株和動物:人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞永生化株HaCaT(ATCC);清潔級C57BL/6小鼠(雌雄各半，8～12周齡，購于南通大學(xué))。(2)藥物和試劑:鹽酸13－己基小檗堿(中國藥科大學(xué)李耐三教授提供，含量99．36%);他克莫司(浙江萬馬藥業(yè)有限公司提供，含量99．4%);雷公藤內(nèi)酯醇(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所藥物研究室提供，含量99.78%);丙酸氯倍他索(天津藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，含量98．2%);重組人腫瘤壞死因子 －α(rhTNF－α，美國 Peprotech);伴刀豆球蛋白A(ConA，Sigma);脂多糖(LPS，Sigma);人TNF－α、IL－8和小鼠IL－1βELISA檢測試劑盒(R＆D公司生產(chǎn)，北京四正柏生物有限公司分裝)。(3)儀器:312nm窄波UVB照射儀(德國Waldmann－medizintechnik公司)。

2．方法:(1)小鼠T淋巴細(xì)胞活化試驗:小鼠脾臟剪碎后用RPMI1640完全培養(yǎng)液制成3×106/毫升懸液，用10μg/ml ConA活化。接種96孔培養(yǎng)板，0．1毫升/孔，加入不同濃度受試藥液0．1毫升/孔，設(shè)平行3孔。同時設(shè)ConA刺激物對照組、空白細(xì)胞對照組、溶媒對照組，37℃、5%CO2中培養(yǎng)60h。各孔加5mg/m l MTT 20μl培養(yǎng)4h。棄上清，細(xì)胞用 SDS液(0．1毫升/孔)裂解，培養(yǎng)24h后測定OD550值，計算細(xì)胞存活率。(2)HaCaT細(xì)胞增殖試驗:對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞常規(guī)消化后按5×105/ml接種96孔板。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的受試物作用48h。每孔加5mg/ml MTT 20μl后再孵育4h，去上清后加入150μl DMSO，測定 OD550值，計算細(xì)胞存活率。(3)細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)試驗:①IL－8:對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞，按3×105/m l接種96孔板，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)8h，更換無血清培養(yǎng)基作同步化處理過夜。加入不同濃度rhTNF－α刺激48h。收集細(xì)胞上清，離心后ELISA檢測，確定最適誘導(dǎo)濃度;②TNF－α:對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞，按1×106/ml接種直徑3cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜后在312nm UVB窄波照射儀上分別按96．6mJ/cm2和124．2mJ/cm2劑量照射。補充培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24h，上清經(jīng)ELISA檢測后確定最適照射劑量;③IL－1:用含5%胎牛血清的Hanks液注入C57BL/6小鼠腹部制備腹腔巨噬細(xì)胞。按2×106/ml接種24孔培養(yǎng)板，1毫升/孔，貼壁培養(yǎng)4h后加 LPS(10μg/ml)刺激 48h，收集上清供ELISA檢測。(4)藥物影響試驗:HaCaT細(xì)胞或小鼠腹腔巨噬細(xì)胞按上述方法接種后加入不同濃度藥液，預(yù)處理120min后分別用25ng/ml rhTNF－α，或124．2mJ/cm2的窄波UVB照射 ，或10μg/ml LPS誘導(dǎo)，合并藥物處理，24或48h后收集上清供ELISA檢測。實驗設(shè)溶媒對照組、無藥對照組和空白細(xì)胞對照組。(5)ELISA測定IL－8、TNF－α和IL－1β水平:按試劑盒說明操作。先用細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將不同稀釋度的待檢樣品進(jìn)行測定，根據(jù)OD450換算細(xì)胞因子蛋白含量。

結(jié) 果

1．受試物對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響:結(jié)果見圖1。在0．05 ～0．39μg/m l濃度范圍，鹽酸13 － 己基小檗堿明顯抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，并有劑量依賴性趨勢。對照藥丙酸氯倍他索在0．1μg/m l的抑制率可達(dá)80%以上。

2．受試物對HaCaT細(xì)胞增殖的影響:表1顯示，作用48h后鹽酸13－己基小檗堿在0．05～0．78μg/ml范圍內(nèi)對細(xì)胞活力影響較小(抑制率＜15%)，而在1．56 ～6．25μg/ml對 HaCaT 細(xì)胞增殖影響較大(抑制率＞60%)。對照藥雷公藤內(nèi)酯醇在≥10－1μg/ml、他克莫司在≥100μg/ml時的抑制率在20%以上。

3．細(xì)胞因子的體外誘導(dǎo):(1)HaCaT細(xì)胞在自然狀態(tài)下產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的IL－8，在25、50和100ng/ml rhTNF－α刺激48h后，IL－8的生成明顯增加(P＜0．01)，約為基礎(chǔ)量的4～5倍，3個rhTNF－α濃度組間無明顯差異。(2)采用 312nm UVB 96．6和124.2mJ/cm2兩種劑量照射后，HaCaT細(xì)胞TNF－α產(chǎn)生明顯增加，其中124．2mJ/cm2劑量組的生成量高達(dá)447pg/ml(P＜0．01)。(3)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用10μg/ml LPS刺激48h后，IL－1β表達(dá)水平可上調(diào)至3276pg/ml(P＜0．01)。基于以上結(jié)果，在后續(xù)藥物實驗中選擇25ng/ml rhTNF－α、124．2mJ/cm2UVB 和10μg/ml LPS分別作為 IL－8、TNF－α和 IL－1β的刺激條件。

4．受試物對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響:圖2和圖3顯示，0．05 ～0．78μg/ml濃度范圍的鹽酸13 － 己基小檗堿劑量依賴性地抑制25ng/ml rhTNF－α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL－8的上調(diào)作用和124．2mJ/cm2窄波UVB照射后引起的TNF－α表達(dá)，對照藥他克莫司和雷公藤內(nèi)酯醇的劑量依賴性抑制作用明顯。對10μg/ml LPS刺激引起的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL－1β的表達(dá)，鹽酸13－己基小檗堿在0．01μg/ml時的抑制率可達(dá)50%，并顯示量－效趨勢(圖4)，0．1μg/ml丙酸氯倍他索的抑制率為94%。

表1 不同濃度受試物作用48h對HaCaT細(xì)胞活力的影響(x±s)

圖1 不同濃度鹽酸13－己基小檗堿處理后對10μg/m l ConA刺激的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖的影響

討 論

皮損中活化的T淋巴細(xì)胞浸潤是炎癥性皮膚病的典型標(biāo)志。Kastelan等［5］認(rèn)為，皮膚局部聚集的具有特殊活性的CD4+T細(xì)胞及其分泌的Th1型細(xì)胞因子是觸發(fā)銀屑病復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵。本研究表明鹽酸13－己基小檗堿對小鼠T淋巴細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(IC50≈0．123μg/ml)，提示該化合物可通過抑制T淋巴細(xì)胞活化而可阻斷后續(xù)的免疫－炎癥效應(yīng)。表皮角質(zhì)形成細(xì)胞是炎癥性皮膚病局部治療的直接靶細(xì)胞。結(jié)果表明，高濃度組(＞0．78μg/ml)對HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞增殖有明顯影響，而低濃度組(≤0．78μg/ml)的直接影響較小，亦提示此濃度是后續(xù)細(xì)胞因子試驗的上限濃度。TNF－α是皮膚免疫和炎癥過程中具有重要作用的初級細(xì)胞因子，與其他細(xì)胞因子相互促進(jìn)與抑制，形成一個自我維持的炎性過程，并且能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL－8，觸發(fā)皮損局部的免疫炎癥反應(yīng)［6］。IL－8是多功能性趨化因子，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化，促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，同時還能促進(jìn)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究中，靜息狀態(tài)的 HaCaT細(xì)胞在外源性 rhTNF－α和312nm UVB刺激下，IL－8和TNF－α產(chǎn)生分別增加數(shù)倍和數(shù)十倍，鹽酸13－己基小檗堿能明顯抑制它們的產(chǎn)生(IC50分別為0．13 和0．21μg/ml)，提示該作用可能是化合物抗炎作用的重要環(huán)節(jié)。體內(nèi)IL－1β主要由活化的單核－吞噬細(xì)胞產(chǎn)生，通過活化NF－κB等途徑促進(jìn)T細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，導(dǎo)致T細(xì)胞溢出血管進(jìn)入皮膚，同時它也是白細(xì)胞的強趨化劑。鹽酸13－己基小檗堿在0．01～1．00μg/ml濃度范圍對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL－1β產(chǎn)生的抑制率超過50%，進(jìn)一步反映了該化合物通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎效應(yīng)的特征。

本研究中用于對照研究的他克莫司為大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，具有免疫抑制和抗炎作用，在治療特應(yīng)性皮炎和銀屑病等炎癥性皮膚病中有確切療效［7，8］。雷公藤在臨床治療嚴(yán)重型銀屑病等疾病具有特色，雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤抗炎免疫活性的代表化合物。以上兩種藥在本研究中的陽性結(jié)果進(jìn)一步證實了它們的功效。通過抑制IL－8、TNF－α和IL－1β的產(chǎn)生，繼而可影響炎癥細(xì)胞聚集等皮膚炎癥后續(xù)事件，表明了鹽酸13－己基小檗堿具有治療炎癥性皮膚病的潛力。該化合物為非甾體結(jié)構(gòu)，其對激素依賴性皮炎具有特殊意義，我們以往的研究已經(jīng)證實該化合物對NF－κB信號途徑的活化有明顯的干預(yù)作用，有關(guān)它的抗炎機制的深入研究正在進(jìn)行之中［4］。

(志謝:中國藥科大學(xué)李耐三教授提供研究樣品，在此表示感謝)。

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