基于氣相色譜－質(zhì)譜的肥胖抵抗大鼠尿液代謝組學(xué)研究

辛衍代 季 虹 劉興艷 張 麗 榮海欽

代謝組學(xué)的研究方法能對生物流體中的代謝產(chǎn)物和代謝中間物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)由疾病過程引起的代謝異常，幫助人們更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑，還有助于疾病的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和輔助臨床診斷的目的［1，2］。氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)聯(lián)用技術(shù)具備較為完善的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，其操作簡便，且具有較強(qiáng)的分離分析能力，已得到廣泛的應(yīng)用［3，4］。由生活因素特別是高糖高脂飲食導(dǎo)致的肥胖型2型糖尿病等代謝性疾病已引起人們的高度重視，而肥胖抵抗型2型糖尿病等代謝性疾病目前研究較少。尿液是整體代謝終產(chǎn)物輸出的主要途徑之一，尿液中代謝物的波動不僅能夠反映機(jī)體整體代謝的特征，還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現(xiàn)，且尿液樣品的收集無創(chuàng)、方便等特點(diǎn)使操作簡便易行。本研究建立了一套基于GC－MS技術(shù)的代謝組學(xué)分析方法，用于研究高糖高脂飲食導(dǎo)致的肥胖抵抗Wistar大鼠模型的物質(zhì)能量代謝特點(diǎn)。大鼠尿液經(jīng)樣品前處理之后進(jìn)行GC－MS分析，采集的數(shù)據(jù)經(jīng)過峰匹配、歸一化校正、正交信號校正技術(shù)(OSC)濾噪后進(jìn)行多變量分析，尋找差異代謝物，以對非肥胖型2型糖尿病等代謝性疾病的的發(fā)病機(jī)制有更深入的了解。

在對養(yǎng)路機(jī)械進(jìn)行設(shè)備點(diǎn)檢的過程中，為確保點(diǎn)檢工作落到實(shí)處，應(yīng)對點(diǎn)檢結(jié)果進(jìn)行查驗(yàn)，進(jìn)而避免設(shè)備點(diǎn)檢中出現(xiàn)虛假查驗(yàn)問題，保障點(diǎn)檢工作的認(rèn)真落實(shí)。在進(jìn)行設(shè)備點(diǎn)檢檢查管理時，主要是對點(diǎn)檢的結(jié)果進(jìn)行查驗(yàn)，并利用賞罰分明的點(diǎn)檢管理制度進(jìn)行謊檢問題進(jìn)行嚴(yán)肅的處理。

材料與方法

1．試劑和儀器:尿酶(172U/mg，TOYOBO)、甲醇(色譜純，TEDIA)、吡啶(色譜純，F(xiàn)luka)、正庚烷(色譜純，科密歐)、BSTFA(ALDRICH)。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890A－5975C)，配有自動進(jìn)樣器，高速低溫離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5417R)。高糖高脂飼料:20%動物脂肪，5%的葡萄糖，5%的果糖，5%的膽固醇，其他的為基礎(chǔ)飼料。

2．肥胖抵抗大鼠模型的建立:選用雄性Wistar健康大鼠，體重250±20g，從山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購買。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)挑選8只大鼠喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，作對照組(CR)，其他20只喂養(yǎng)高糖高脂飲食，16周后稱體重，按照體重增加量再次排序，上1/3大鼠(7只)為肥胖組大鼠，與中間1/3大鼠(6只)均剔除，下1/3大鼠(7只)為肥胖抵抗組大鼠(OR)，即本研究的實(shí)驗(yàn)對象［5］。為測定相關(guān)指標(biāo)，把對照組及肥胖抵抗組大鼠放入代謝籠收集24h尿液，－20℃保存［6］。并禁食8h后尾靜脈采集空腹血，測生化指標(biāo)。

3．樣品前處理:取200μl尿于1．5m l離心管中，加20μl尿酶的磷酸鹽緩沖液(50mg/ml)，37℃反應(yīng)30min，以去除尿中的尿素，加 600μl甲醇，震蕩混勻，超聲 30s，－20℃ 放置10min，高速離心機(jī)離心(4℃，轉(zhuǎn)速 10000r/min)，10min，取上清液400μl，真空干燥，加入50μl甲氧胺的吡啶溶液(15mg/m l)，25℃肟化 16h，加 40μl BSTFA，70℃ 衍生 30min，加 70μl正庚烷混勻，離心取上清，準(zhǔn)備分析［7］。

5．?dāng)?shù)據(jù)處理:根據(jù)GC－MS總離子流圖中各峰的保留時間進(jìn)行峰匹配，峰面積經(jīng)歸一化法校正后導(dǎo)入SIMCA－P11．5(Umea，Sweden)進(jìn)行多變量分析，得到的可能標(biāo)志物導(dǎo)入到SPSS 11．5進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann－Whitney U，P ＜0．05)［8］。利用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對可能標(biāo)志物做鑒定，通常匹配度＞800(最高值1000)且可能性＞80%的鑒定結(jié)果較為可信［9］。

1．尿酶加入量的確定:同一尿樣，分別加入5、10、20μl尿酶，其余處理方法相同。經(jīng)過GC－MS分析發(fā)現(xiàn)，加入20μl尿酶能把尿液中含有的大部分尿素去除，效果較好，因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)蛎讣尤肓繛?0μl(圖3)。

針對強(qiáng)蝕變巖洞段呈很濕或飽和狀情況時，在掌子面和護(hù)盾位置極易形成大面積塌方或流沙，此時TBM掘進(jìn)和支護(hù)均無法施做，且存在卡機(jī)危險(xiǎn)。為了確保施工安全，應(yīng)首先對該位置進(jìn)行超前預(yù)注漿加固，由于普通漿液存在固結(jié)刀盤風(fēng)險(xiǎn)，本洞段采用化學(xué)灌漿，化學(xué)灌漿材料由A、B兩種組份構(gòu)成，二者比例為1∶1。

結(jié) 果

1．生化指標(biāo):高糖高脂飲食干預(yù)16周之后，稱重、測空腹血生化指標(biāo)。肥胖抵抗組體重并未有顯著變化(331±30g vs 303±45g)，但是空腹胰島素、血糖均顯著升高(P＜0．05)，表明肥胖抵抗大鼠已發(fā)生了胰島素抵抗和糖代謝紊亂。低密度脂蛋白、總膽固醇顯著升高(P＜0．05)，高密度脂蛋白顯著下降(P＜0.05)，而甘油三酯卻顯著下降(0．68±0．15mmol/L vs 0．42 ±0．17mmol/L，P ＜0．05，表 1)。這說明肥胖抵抗大鼠的脂代謝也已發(fā)生紊亂，研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病人胰島素抵抗和超低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白有密切的關(guān)系［10］。糖、脂代謝異常表明代謝紊亂的模型建立成功。

表1 肥胖抵抗組和對照組生化指標(biāo)

為克服上述困難,人們將大量的碳納米管通過一定方式組裝成一維連續(xù)的纖維[5-7].采用傳統(tǒng)纖維復(fù)合材料制備工藝,可以獲得高取向、高含量碳納米管復(fù)合材料.進(jìn)入21世紀(jì)以來,人們先后開發(fā)了溶液紡絲法、碳納米管陣列紡絲法,以及化學(xué)氣相沉積直接制備法等碳納米管纖維制備方法,同時也對碳納米管纖維的力學(xué)、電學(xué)和熱學(xué)性能進(jìn)行了系統(tǒng)研究.初步的研究結(jié)果表明,碳納米管纖維的比強(qiáng)度和比剛度均超過了已有碳纖維,其強(qiáng)度已高達(dá)8.9 GPa,而且具有和碳纖維相比更優(yōu)異的導(dǎo)電和導(dǎo)熱特性[6].

2．GC－MS數(shù)據(jù)的多變量分析:GC－MS采集的數(shù)據(jù)經(jīng)峰匹配、歸一化校正之后進(jìn)行多變量分析。主成分分析(PCA)是一種無師監(jiān)督模式識別方法，可以直觀地在多維空間上描述樣品間的差異。從圖1可以看出質(zhì)控樣本較好的聚合在一起，說明本實(shí)驗(yàn)的分析誤差小于樣本間的固有差異。但是對照組和肥胖抵抗組的差異不明顯，這主要是由于尿樣在收集過程中會產(chǎn)生多余的干擾因素，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行濾噪處理［11］。正交信號校正技術(shù)(OSC)能濾掉與類別判斷正交的變量信息，消除多余的干擾因素，有利于模式識別分類的成功［2］。數(shù)據(jù)經(jīng)OSC濾噪之后進(jìn)行了最小二乘判別分析(PLS－DA)，由圖2A可看出，對照組和肥胖抵抗組大鼠分別在不同的區(qū)域，具有較大的差別，模型的 R2Y和 Q2值分別為 0．929和0.905，說明模型具有較好的預(yù)測能力。過擬合測試中R2截距和 Q2截距分別為0．0775和 －0．28，說明模型不存在過度擬合［12］。PLS－DA模型載荷圖(圖2B)反映了輸出變量對樣品分類的影響，距離載荷矩陣圖中心遠(yuǎn)的為可能的生物標(biāo)志物，對這些化合物做非參數(shù)檢驗(yàn)，最終得到15個代謝物在正常對照組和模型組之間有顯著性差異(P＜0．05，表2)。和對照組相比肥胖抵抗組大鼠尿中羥基乙酸、蘇氨酸、絲氨酸、丁二酸、延胡索酸、2，3－二羥基－丁酸、蘋果酸、羰基戊二酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸、葡萄糖醇、反式烏頭酸、果糖、葡萄糖、肌醇含量減少。

圖1 大鼠尿樣的主成分分析得分圖Class 1．正常對照組;Class 2．肥胖抵抗組;Class 3．質(zhì)控樣品

討 論

4．分析條件:進(jìn)樣 1μl，分流比 10∶1。色譜柱:DB －5MS(30m ×0．25mm ×0．25μm)。柱溫:70℃持續(xù) 2min→以 7℃ /min的速度加熱至180℃→以5℃/min的速度加熱至250℃→以25℃/min的速度加熱至290℃，然后再持續(xù)10min。進(jìn)樣口溫度:270℃。接口溫度:280℃。離子源溫度:230℃。載氣:氦氣。載氣流速:40cm/s。電離方式:EI。電子能量:70eV。掃描范圍:40～500m/z。

其中，Bi的11次載氣空白信號值均為零，默認(rèn)其11次載氣空白信號值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為1 CPS[11-13]，計(jì)算得到Bi的檢出限為0.0065μg/g。綜上所述，各元素的檢出限為0.0065～0.31μg/g。

圖2 大鼠尿樣的OSC－PLS－DA分析的得分圖(A)和載荷圖(B)Class 1．正常對照組;Class 2．肥胖抵抗組

2．方法精準(zhǔn)度的驗(yàn)證:取一尿樣，分別取200μl尿于2個1．5ml離心管中，作為質(zhì)控樣品(QC)，與肥胖抵抗組、對照組一起進(jìn)行樣品前處理，建立分析序列進(jìn)行GC－MS分析，每分析8個樣品質(zhì)控樣品各進(jìn)樣1次，共6次。提取共有峰，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。表2列出的是質(zhì)控樣本中部分化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，羰基戊二酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大為11.77，其他的均在10%以內(nèi)，重現(xiàn)性良好。

表2 肥胖抵抗組和對照組差異代謝物

圖3 尿酶加入量的確定

3．高糖高脂干預(yù)后肥胖抵抗組大鼠尿液代謝組學(xué)差異:尿液是人體整體代謝終產(chǎn)物輸出的主要途徑之一，尿液中代謝物的波動不僅能夠反映機(jī)體整體代謝的特征，還可能是局部組織或器官功能異常的外在表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損的大鼠尿液中腸道菌群的代謝物(二甲胺、三甲胺)的濃度升高，認(rèn)為腸道菌群的改變可能和胰島素的抵抗有關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肥胖抵抗組大鼠尿液中對羥基苯甲酸、對羥基苯乙酸顯著減少，它們是腸道菌群代謝飲食中的芳香族氨基酸和多酚類物質(zhì)的產(chǎn)物，它們的減少表明長期的高糖高脂飲食可能改變了宿主的腸道菌群的結(jié)構(gòu)，這可能和胰島素抵抗有關(guān)系。三羧酸循環(huán)是三大營養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的共同代謝途徑，三羧酸循環(huán)的狀況是機(jī)體能量代謝水平的綜合反映。丁二酸、延胡索酸、羰基戊二酸、蘋果酸是三羧酸循環(huán)主要的中間代謝物，它們減少，表明飲食干預(yù)組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗，糖酵解減弱，能量代謝出現(xiàn)異常。蘇氨酸、絲氨酸減少，表明氨基酸代謝出現(xiàn)異常，韓曉菲等研究發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝譜與糖尿病患者血糖高低之間存在相關(guān)性，且蘇氨酸等7種氨基酸代謝與血糖高低密切相關(guān)，有研究顯示這可能和腎小管受損有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肥胖抵抗組尿液中肌醇含量較對照組明顯減少，提示肌醇代謝明顯異常。肌醇具有類似于維生素B1和維生素H(生物素)的作用，是人類與動物維持正常生理功能不可缺少的低分子有機(jī)物，能促進(jìn)肝和脂肪的代謝，肌醇的耗竭也將影響腎小管上皮細(xì)胞正常的生理功能，引起細(xì)胞肥大，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)前膠原的合成與分泌，引起腎間質(zhì)的纖維化而不可逆的，嚴(yán)重者進(jìn)展為終末期腎衰竭。Nissen等通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)肌醇與成年后糖耐量低減及胰島素抵抗有關(guān)聯(lián)。

本實(shí)驗(yàn)研究建立了GC－MS代謝組學(xué)分析方法，并將其應(yīng)用高糖高脂飲食干預(yù)的非肥胖型大鼠尿液的代謝指紋分析。GC－MS采集的數(shù)據(jù)經(jīng)峰匹配、歸一化校正之后進(jìn)行多變量分析，模型具有很好的預(yù)測能力，R2Y和 Q2值分別為 0．929和 0．905，發(fā)現(xiàn) 15個代謝物含量異常，血清生化指標(biāo)也出現(xiàn)異常，表明在經(jīng)過高糖高脂飲食干預(yù)16周之后，Wistar大鼠雖然體重沒有明顯變化，但是糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝發(fā)生異常，而且腸道菌群的結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生變化，這對非肥胖型代謝性疾病，尤其是非肥胖型2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制的研究有重要意義。

1 Holmes E，Wilson ID，Nicholson JK．Metabolic phenotyping in health and disease［J］．Cell，2008，134(5):714 －717

2 Li X，Lu X，Xu G，et al．Comprehensive two－ dimensional gas chromatography/time－of－flightmass spectrometry formetabonomics:Biomarker discovery for diabetesmellitus［J］．Analytica Chimica Acta，2009，633(2):257 －262

3 Zheng XT，Shen J，Liu Q，etal．Plasma fatty acidsmetabolic profiling analysis of coronary heart disease based on GC－MS and pattern recognition［J］．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49(2):481－486

4 Qiu Y，Su M，Jia M，etal．Application of ethyl chloroformate derivat-ization for gas chromatography－mass spectrometry basedmetabonomic profiling［J］．Analytica Chimica Acta，2007，583(2):277 －283

5 Levin BE．Arcuate NPY neurons and energy homeostasis in diet－induced obese and resistant rats［J］．Am JPhysiol，1999，276(2):382 －387

6 孫暉，孫文軍，楊昆，等．基于臨床化學(xué)及代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型評價(jià)研究［J］．中國中醫(yī)藥，2010，8(10):1

7 Jiye A，Trygg J，Gullberg J，et al．Extraction and GC/MS analysis of the human blood plasma metabolome［J］．Anal Chem，2005，77(24):8086－8094

8 Qiu Y，CaiG，JiaW，etal．Serum metabolite profiling of human colorectal cancer using GC－TOFMS and UPLC－QTOFMS［J］．Journal of Proteome Research，2009，8(11):4844－4850

9 Major HJ，Williams R，Wilson AJ，et al．A metabonomic analysis of plasma from Zucker rat strains using gas chromatography/mass spectrometry and pattern recognition［J］．Rapid Commun Mass Spectrom，2006，20(22):3295－3302

10 Pereira S，Marliss EB，Morais JA，et al．Insulin resistance of protein metabolisMin type 2 diabetes［J］．Diabetes，2008，57(1):56 －63

11 盧紅梅，梁逸曾．代謝組學(xué)分析技術(shù)及數(shù)據(jù)處理技術(shù)［J］．分析測試學(xué)報(bào)，2008，27(3):325 －332

12 袁凱龍，石先哲，路鑫，等．洛沙坦治療糖尿病的氣相色譜代謝組學(xué)［J］．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(6):719 －724