高濃度姜黃素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流和內(nèi)向整流鉀電流的影響

施 通 吳 輝 劉付麗 杜永均 高元興 岳 軍 徐旭仲

姜黃素(curcumin)是姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma longa L)的活性成分 ，它在1815年首次被Vogel和Pelletier從根莖中提取的一種酚類天然色素，但直到1870年才被Daube獲得純晶體姜黃素，大約30 年后 Ivanov 和 Gajevsky 才闡明其結(jié)構(gòu)［1，2］。在傳統(tǒng)的印第安醫(yī)學(xué)中它被用以治療各種各樣的疾病，包括風(fēng)濕病、軀體疾病、皮膚病、消化功能紊亂、間歇性發(fā)熱、白斑病和閉經(jīng)等［3，4］。最近幾年，大量研究數(shù)據(jù)闡明了姜黃素非在體條件下的潛在藥理學(xué)作用，包括抗微生物、抗病毒、抗真菌、抗炎和抗腫瘤等作用。

作為一種純天然成分，姜黃素被美國(guó)食品和藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)(FDA)認(rèn)為是安全的［5］。但許多文獻(xiàn)報(bào)道了姜黃素對(duì)各種細(xì)胞的毒性作用，同時(shí)姜黃素劑量依賴性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死最近已經(jīng)被報(bào)道，并指出在非在體模型中高濃度姜黃素能導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷［6～9］。而且有文獻(xiàn)指出高劑量姜黃素會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣的釋放從而增高胞內(nèi)鈣濃度［10，11］。

姜黃素是否會(huì)影響大鼠心室肌細(xì)胞離子通道至今尚不清楚。本項(xiàng)目的研究目的就是為了闡明是否高濃度姜黃素會(huì)帶來(lái)心臟毒性，同時(shí)我們測(cè)試了高濃度姜黃素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(inward rectifier potassium current，Ik1)電生理作用。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑:成年清潔級(jí)SD大鼠250～300g，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。Ⅰ型膠原酶(collagenaseⅠ)，牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)，姜黃素(curcumin)，二甲基亞砜(DMSO)，N－2－羥乙基哌嗪 －N'－2－乙磺酸(HEPES)，乙二醇－雙四乙酸(EGTA)，氯化鎘(CdCl2)，谷氨酸(L－glutamic acid)，牛磺酸(taurine)，CaCl2，K2ATP為Sigma公司產(chǎn)品。其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2．溶液配制:分離心室肌細(xì)胞和記錄離子通道電流所使用的溶液配制如下:①無(wú)鈣臺(tái)氏液:NaCl 137mmol/L，KCl 5.4mmol/L，MgCl21．0mmol/L，NaH2PO40．33mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L，用NaOH調(diào) pH 值至7.35;②KB液:KCl 40mmol/L，KH2PO420mmol/L，MgSO43.0mmol/L，KOH 80mmol/L，谷氨酸 50mmol/L，牛磺酸 20mmol/L，HEPES 10mmol/L，Glucose 10mmol/L，EGTA 0.5mmol/L，用 KOH 調(diào) pH 值至7.35;③Ito和 Ik1電極內(nèi)液:KCl 65mmol/L，KF 80mmol/L，MgCl21.0mmol/L，K2ATP 5.0mmol/L，EGTA 10mmol/L，HEPES 10mmol/L，KOH調(diào)pH值至7．3，記錄Ito和Ik1的細(xì)胞外液為臺(tái)氏液;④50μmol/L姜黃素灌流液:用DMSO配制10mmol/L姜黃素溶液，然后分別用不同通道外液將其稀釋至50μmol/L備用。所有液體均用雙蒸水(RIOS5+，MILLIPORE美國(guó))配制。

3．SD大鼠心室肌細(xì)胞分離:SD大鼠麻醉后取心分別以無(wú)鈣臺(tái)式液和Ⅰ型膠原酶行Langendoff灌流后，獲得酶解分離后的心室肌細(xì)胞，并置入含BSA的KB液穩(wěn)定1h后備用。

4．全細(xì)胞膜片鉗記錄:在倒置顯微鏡(TE2000－U，Nikon，日本)下選擇邊緣清楚，表面光滑，橫紋清晰，無(wú)收縮的細(xì)胞。采用Hamill等首創(chuàng)的全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄各種通道電流。

5．通道電流的刺激參數(shù)設(shè)置:記錄Ito時(shí)細(xì)胞外液中加入CdCl20．3mmol/L以阻斷鈣電流，加入CoCl21mmol/L以阻斷鈣激活氯電流(Ito2)。記錄Ito的I－V曲線時(shí)Vh為－90mV，先給予1個(gè)25ms～－40mV的去極化刺激以滅活 INa。Vs從－40mV開始，以10mV階躍刺激至+50mV，時(shí)程400ms，頻率0．2Hz。記錄Ik1細(xì)胞外液中加入CdCl20．3mmol/L以阻斷鈣電流。記錄Ik1的I－V曲線時(shí)Vh為－40mV，Vs從－120mV開始，以10mV 階躍刺激至 +50mV，時(shí)程400ms，頻率0．2Hz。

6．姜黃素灌流和數(shù)據(jù)采集:每個(gè)通道電流記錄時(shí)細(xì)胞灌流藥物前采集對(duì)照電流曲線，然后用微灌流系統(tǒng)(DADVC－8PP，ALA SCIENTIFIC，美國(guó))，灌流50μmol/L 姜黃素 5min，記錄灌藥后的電流曲線，然后用空白細(xì)胞外液沖洗5min再次記錄電流曲線。原始電流數(shù)據(jù)采用pulsefit進(jìn)行分析和測(cè)量，Originpro8．5 繪圖。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，給藥前后采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．姜黃素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞鉀離子通道的抑制率:(1)Ito:以測(cè)試電壓50mV，對(duì)5個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞的Ito峰值電流密度作觀察指標(biāo)，得出50μmol/L姜黃素對(duì)Ito的抑制率為(84±11)%(表1)。圖1為50 μmol/L姜黃素對(duì)Ito影響的原始電流圖。(2)Ik1:以測(cè)試電壓－80mV，對(duì)5個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞的 Ik1峰值電流密度作觀察指標(biāo)，得出50μmol/L姜黃素對(duì)Ik1的抑制率為(59±8)%(表1)。圖2為50μmol/L姜黃素對(duì)Ik1影響的原始電流圖。

表1 姜黃素(50μmol/L)對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞Ito和Ik1的影響(x±s)

2．姜黃素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞Ito和Ik1電流密度－電壓曲線的影響:(1)50μmol/L姜黃素對(duì)Ito電流密度－電壓曲線的影響如圖3所示，Ito的激活電壓在－10mV，電流隨刺激電壓增高而增大，并呈現(xiàn)出外向整流的特點(diǎn)。50μmol/L的姜黃素對(duì)所有指令電壓條件下均引起Ito的降低，但不改變其外向整流的特點(diǎn)。(2)50μmol/L姜黃素對(duì)Ik1電流密度－電壓曲線的影響如圖4所示，Ik1在－70～－40mV的刺激電壓以下呈現(xiàn)很強(qiáng)的內(nèi)向整流特點(diǎn)，隨后轉(zhuǎn)為外向整流。50μmol/L的姜黃素對(duì)所有指令電壓條件下均引起Ik1的降低，但不改變其整流性的兩個(gè)階段。

討 論

在本項(xiàng)研究中，我們測(cè)試了姜黃素對(duì)急性酶解分離大鼠心室肌細(xì)胞離子通道功能的影響。姜黃素自從結(jié)構(gòu)被確定以來(lái)，被證明有多種藥理學(xué)效果和治療作用，同時(shí)也是最近研究的熱點(diǎn)。在藥物對(duì)心肌的治療作用和毒性反應(yīng)中起主要作用的3種離子通道分別是鈉、鉀和鈣通道。用一種相對(duì)簡(jiǎn)單的構(gòu)效關(guān)系來(lái)解釋就是藥物通過改變一種細(xì)胞膜或胞內(nèi)離子通道的活性來(lái)干預(yù)心臟功能，引起節(jié)律細(xì)胞、傳導(dǎo)纖維和(或)收縮細(xì)胞不正常的除極和(或)復(fù)極從而導(dǎo)致心臟節(jié)律的破壞和心臟收縮舒張功能失常。現(xiàn)在普遍認(rèn)為藥物引起心臟的毒性作用不僅僅是指?jìng)鹘y(tǒng)意義上的心血管藥物，而可以是任何化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥物，只要它能影響心臟功能，甚至在某一時(shí)刻能引起致命的影響。我們通過觀察姜黃素對(duì)離子通道的作用來(lái)評(píng)估其對(duì)心臟電生理的影響。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素和離子通道的關(guān)系對(duì)研究和探討心臟毒性、不良反應(yīng)和治療效果都有至關(guān)重要的作用。

最近，Enyeart等報(bào)道了姜黃素是目前對(duì)牛腎上腺束狀帶細(xì)胞Kv1．4鉀通道最強(qiáng)的抑制劑，同時(shí)它還抑制bTREK－1鉀離子通道，并刺激腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞分泌皮質(zhì)醇。他們假設(shè)姜黃素的某些生物學(xué)特性包括它的治療作用，可能通過調(diào)節(jié)鉀離子通道的抑制率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Kv1．4通道的電流相對(duì)于大鼠心室肌細(xì)胞而言就是Ito電流。它是一種心臟動(dòng)作電位早期復(fù)極中瞬間激活和失活的鉀電流。Ito電流量的下降會(huì)明顯減慢1期復(fù)極，并抬高動(dòng)作電位平臺(tái)。同時(shí)Ito電流改變導(dǎo)致的動(dòng)作電位復(fù)極改變會(huì)對(duì)L型鈣電流幅度和時(shí)程有較大影響，從而相應(yīng)的影響肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子負(fù)荷、釋放和細(xì)胞收縮能力。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制Ik1電流，而Ik1電流又是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位中穩(wěn)定靜息膜電位，決定興奮起點(diǎn)和啟動(dòng)復(fù)極的主要電流。這種電流的特點(diǎn)是當(dāng)細(xì)胞膜輕度去極化時(shí)鉀離子外流，而進(jìn)一步去極化時(shí)，鉀離子外流反而減少甚至消失。具有明顯的內(nèi)向整流性質(zhì)，所以被命名為內(nèi)向整流鉀電流，其典型的電流曲線呈“N”形。因此，調(diào)節(jié)Ik1電流對(duì)于心臟興奮性和心臟節(jié)律相當(dāng)重要，Ik1電流被抑制會(huì)導(dǎo)致QT間期延長(zhǎng)，尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速，室性心室顫動(dòng)甚至猝死。

根據(jù)本課題組另一項(xiàng)對(duì)大鼠心臟離體灌流的實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度姜黃素(0．1 ～10．0μmol/L)具有劑量依賴性的心臟功能增強(qiáng)作用，而高濃度姜黃素(10～50μmol/L)能產(chǎn)生劑量依賴性的心臟功能抑制和致心律失常作用。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)濃度＞50μmol/L的姜黃素灌流液會(huì)使心肌細(xì)胞短期內(nèi)死亡，所以以50μmol/L的濃度為例探討姜黃素對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明高濃度姜黃素(50μmol/L)對(duì)心室肌細(xì)胞多通道的綜合作用，可以解釋離體灌流心臟的心電圖產(chǎn)生的PR間期延長(zhǎng)、QRS電壓下降和時(shí)程延長(zhǎng)等現(xiàn)象，同時(shí)也可以解釋心肌功能抑制，收縮力減弱，心律失常等現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)初步研究了高濃度姜黃素對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞離子兩種鉀離子通道的影響，提示高濃度姜黃素對(duì)心臟具有一定的心肌抑制和致心律失常作用。低濃度的姜黃素是否也會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞離子通道電流產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步研究明確。

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