W nt誘導(dǎo)分泌蛋白3對(duì)軟骨細(xì)胞增殖分化的作用

黃 佼 馬麗珍 詹宇紅 陳 軍

Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白3(Wnt－inducible secreted protein 3，WISP3)基因定位于染色體6q21～22，編碼1個(gè)354個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大約40kDa，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，每一個(gè)結(jié)構(gòu)域由對(duì)應(yīng)的基因外顯子編碼，外顯子1編碼信號(hào)肽，外顯子2編碼的結(jié)構(gòu)域與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)氨基末端同源，根據(jù)WISP3蛋白結(jié)構(gòu)提示其功能與某些其他蛋白質(zhì)具有相似性。WISP3基因突變與晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病(spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy，SEDT －PA)的發(fā)病密切相關(guān)［1，2］。SEDT －PA 是一種主要累及軟骨組織的常染色體隱性遺傳性疾病，1982年由Wynne－Davies等首先報(bào)道，該病的組織學(xué)表現(xiàn)為靜止帶和生長(zhǎng)帶的軟骨細(xì)胞呈巢樣聚集，提示該疾病可能是由于關(guān)節(jié)軟骨的原發(fā)性病變所致［3］。

研究證明胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(IGF－1)可介導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的上調(diào)WISP3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域1與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)的結(jié)構(gòu)同源，推測(cè)WISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達(dá)可能與 IGF－1信號(hào)通路有關(guān)［4～6］。本實(shí)驗(yàn)研究WISP3蛋白對(duì)人永生化軟骨細(xì)胞增殖和分化的作用，并初步探討這些作用是否與IGF－1信號(hào)通路相關(guān)，并為進(jìn)一步闡明SEDT－PA發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑:無(wú)酚紅的DMEM培養(yǎng)液、胰酶－EDTA、Aprotinin和苯甲基磺酰氟(PMSF)(Sigma公司，St．Louis，MO，USA);胎牛血清(FBS)(GIBICO 公司，Grand Island，NY);β － actin 鼠抗(Sigma公司，St．Louis，MO，USA);兔抗WISP3多克隆抗體;羊抗Ⅱ型膠原多克隆抗體;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗羊、抗鼠的二抗Santa Cruz(Santa Cruz，CA，USA);預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Maker購(gòu)自Fermentas公司;人重組WISP3蛋白(rhWISP3)，人重組IGF－1蛋白(rhIGF－1)(Peprotech，London，UK);硝酸纖維素膜和ECL試劑盒購(gòu)于Amersham Pharmacia公司 (Arkington Heights，IL，USA)。人永生化軟骨細(xì)胞株T/C－28a2由Mary B．Goldring教授惠贈(zèng)。

2．T/C－28a2細(xì)胞株培養(yǎng)及干預(yù):人軟骨細(xì)胞株T/C－28a2用 DMEM/Ham'F －12(1∶1，v/v)混合培養(yǎng)液(Sigma，D0547)在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。每3～5天換液1次，細(xì)胞匯片后用 0．05% 胰酶 －EDTA(0．05% 胰酶，0．53mmol/L EDTA，GBICO#25300－054)消化。T/C－28a2細(xì)胞接種于24孔板，接近匯片時(shí)棄培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)基(含0．25%BSA)饑餓24h，用重組 WISP3 蛋白 0、100、200、400、800、1600ng/ml干預(yù)24h，抽提細(xì)胞總蛋白用免疫印記分析軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)。

3．細(xì)胞增殖測(cè)定:T/C－28a2細(xì)胞接種到24孔板，每孔500μl培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)平行孔。接近匯片時(shí)棄培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)基(含0．25%BSA)饑餓24h，在有或無(wú)20ng/ml rhIGF －1 誘導(dǎo)下，用 rhWISP3 0、100、200、400、800、1600ng/ml干預(yù)24h。80%～90%融合時(shí)加入［3H］－脫氧胸腺嘧啶進(jìn)行(［3H］－TdR)標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)8h后輕輕棄去培養(yǎng)液，加入2m l預(yù)冷的10%三氯乙酸(TCA)液10min，10%TCA液反復(fù)洗滌3 次。24 孔板加入03N NaOH·SDS 液0．5ml，60℃，30min。冷卻到室溫，收集細(xì)胞裂解液，加入3ml閃爍液，液閃儀測(cè)量各孔每分鐘放射性活性(cpm值)。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的量［3H］－TdR，反映細(xì)胞增殖活性。

4．IGF－1信號(hào)通路的初步研究:T/C－28a2細(xì)胞接種到24孔板接近匯片時(shí)棄培養(yǎng)液，換無(wú)血清培養(yǎng)基(含0．25%BSA)饑餓24h后，在有或無(wú)IGF－1信號(hào)通路的阻斷劑JB1(1．0 μg/ml)干預(yù)的情況下，用 rhWISP3(400μg/m l)和(或)rhIGF－I(20ng/ml)干預(yù)24h，抽提細(xì)胞總蛋白用免疫印記分析軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)。

5．蛋白免疫印跡(Western blot):取細(xì)胞40μg總蛋白與4×SDS加樣緩沖液混勻，100℃ 加熱蛋白變性5min，點(diǎn)樣于10%SDS－PAGE膠中電泳，再電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBS－吐溫封閉1h，用含人Ⅱ型膠原抗體(1∶500稀釋)的PBS溫育2h，PBS－吐溫洗膜10min×3次。用含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗鼠二抗(1∶4000稀釋)的PBS孵育1h，PBS－吐溫洗膜10min×3次，洗膜后ECL發(fā)光自顯影，洗片顯帶。同一張膜洗脫后，用1∶1000稀釋的羊抗鼠β－actin(sc1616，Santa Cruz公司)一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗羊二抗(1∶4000稀釋)重新雜膜，發(fā)光自顯影，洗片顯帶作為內(nèi)對(duì)照。所有雜交信號(hào)在成像分析儀系統(tǒng)測(cè)定條帶密度。Ⅱ型膠原蛋白目的條帶水平以Ⅱ型膠原/β－actin的光密度比值表示。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上，重復(fù)性好。所選圖表為重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之一。數(shù)據(jù)結(jié)果均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)采用SPSS 11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較用方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．rhWISP3對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的作用:根據(jù)［3H］－TdR 參 入 法，與 對(duì) 照 組 比 較 100、200、400、800、1600ng/ml rhWISP3蛋白干預(yù)對(duì)軟骨細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。各濃度液閃儀計(jì)數(shù)cpm值分別為76500．3±1200．8、76202．8 ± 1005．6、77463．6 ± 1356．3、75100.5 ±2423．6、75036．2 ±1698．3、74632．8 ±1896．4 次/分(圖1)。

圖1 不同濃度rhW ISP3對(duì)T/C－28a2細(xì)胞增殖活性的影響

2．rh IGF－1對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的作用:與對(duì)照組比較，20ng/ml rhIGF－1(對(duì)照組1)干預(yù)顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖(130134．7 ±1789．6 次/分，76500．3 ±1200．8 次/分，圖2)。

3．rhWISP3對(duì)rh IGF－1促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用:不同濃度rhWISP3干預(yù)對(duì)rh IGF－1促增殖作用無(wú)明顯影響 (130134.7±1789.6，132580.3±2563.2，130069.4 ± 1963.4，131523.3 ± 2203.9，133567.3 ±2765.3，129980.6 ±2253.6，圖2)。

4．rhWISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原，呈劑量依賴性:Western blot印記雜交檢測(cè)顯示rhWISP3不同濃度能顯著促進(jìn)T/C－28a2細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原，從50～1600ng/ml呈劑量依賴性(圖3)。

圖2 不同濃度rhW ISP3蛋白對(duì)rh IGF－I促細(xì)胞增殖活性的影響

圖3 rhW ISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)

5．rhWISP3對(duì)IGF－1信號(hào)通路的影響:Western blot印記雜交檢測(cè)顯示rhWISP3或rh IGF－1單獨(dú)干預(yù)T/C－28a2細(xì)胞均能顯著促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原。IGF－1信號(hào)通路的阻斷劑JB1干預(yù)的情況下，能取消rh IGF－1促進(jìn)Ⅱ型膠原表達(dá)的作用。JB1不能取消rhWISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的作用(圖4)。

討 論

圖4 JB1干預(yù)細(xì)胞前后對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)的影響

由于人原代軟骨細(xì)胞難于獲得，且從活體分離后的細(xì)胞失去其正常的生活環(huán)境，幾乎沒有增殖活性，本實(shí)驗(yàn)選用的軟骨細(xì)胞株T/C－28a2，是來(lái)源于青少年的肋軟骨，通過(guò)原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染編碼SV40抗原的反轉(zhuǎn)錄病毒獲得永生化的軟骨細(xì)胞株，是現(xiàn)今研究軟骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)調(diào)節(jié)的一種重復(fù)性較好的軟骨細(xì)胞模型，能特異性的表達(dá)Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和SOX－9［8］。人永生化的軟骨細(xì)胞株與原代細(xì)胞相比也有一些局限性，如有較強(qiáng)的增殖活性，而表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)的能力較弱，所以它并不能完全取代人原代軟骨細(xì)胞用于研究軟骨細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)rh-WISP3對(duì)T/C－28a2軟骨細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，而rh IGF－1能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。rh IGF－1促增殖作用是通過(guò)活化IGF－1R，繼而活化下游的IRS－1及MAPK信號(hào)通路而產(chǎn)生作用。不同濃度rh-WISP3干預(yù)對(duì)rh IGF－1促增殖作用無(wú)明顯影響。Matsumoto等［9］的實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGFBP－3能顯著抑制rh IGF－1促增殖作用，而IGFBP－5不能抑制rh IGF－1促增殖作用。雖然WISP3結(jié)構(gòu)域IGFBP與IGFBPs同源，且可能具有類似的功能，但是即使同屬IGFBPs的IGFBP－3和IGFBP－5也可能對(duì)細(xì)胞增殖有不同的影響。

Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要特異性成分，是成熟軟骨細(xì)胞分化的典型標(biāo)志，SEDT－PA一個(gè)可能的發(fā)病機(jī)制是細(xì)胞成熟障礙［10］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)rhWISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原，呈劑量依賴性，表明WISP3基因能明顯地促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化，這與Sen等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。Sen等將野生型和SEDT－PA相關(guān)的WISP3基因突變(Cis78－Arg)轉(zhuǎn)染人永生化軟骨細(xì)胞株T/C－28a2，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染野生型WISP3基因Ⅱ型膠原表達(dá)增加。但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果并未在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中復(fù)制成功，WISP3基因敲除的小鼠并未出現(xiàn)SEDT－PA的表型，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP3基因的小鼠也未出現(xiàn)與野生型小鼠不同的表型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因至今仍未闡述清楚［11，12］。

我們的實(shí)驗(yàn)欲初步探討WISP3基因上調(diào)Ⅱ型膠原表達(dá)是否通過(guò)IGF－1信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)中使用IGF－1信號(hào)通路的阻斷劑JB1。JB1是一種IGF－1的類似物，能與IGF－1R結(jié)合而抑制IGF－1R自身的磷酸化，在功能上表現(xiàn)為IGF－1信號(hào)通路的阻滯劑。

多個(gè)實(shí)驗(yàn)室均證明IGF－1上調(diào)Ⅱ型膠原的的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)用JB1阻斷IGF－1信號(hào)通路的作用后，取消了IGF－1介導(dǎo)的Ⅱ型膠原的上調(diào)［13］。Western blot印記雜交檢測(cè)顯示rhWISP3或rh IGF－1均能顯著促進(jìn)T/C－28a2表達(dá)Ⅱ型膠原。IGF－1信號(hào)通路阻斷劑JB1干預(yù)的情況下，能取消rh IGF－1促進(jìn)Ⅱ型膠原表達(dá)的作用，但JB1不能取消rhWISP3促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的作用。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示W(wǎng)ISP3可能不是通過(guò)IGF－1信號(hào)通路產(chǎn)生促細(xì)胞外基質(zhì)上調(diào)的作用。這與Lorenzatti等在炎性乳腺癌(inflammatory breast cancer，IBC)中的研究結(jié)果有差異，他們的研究認(rèn)為rhWISP3能通過(guò)IGF－1信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)，減弱乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力［14］。不同位點(diǎn)的WISP3基因突變與SEDT－PA的發(fā)病密切相關(guān)，WISP3基因也是一種腫瘤抑制基因，Kleer等發(fā)現(xiàn)80%IBC組織中不表達(dá)WISP3基因，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISP3基因的SUM149細(xì)胞部分取消了IBC腫瘤組織血管生成能力［15］。但SEDT－PA患者并沒有報(bào)告有更高的IBC的發(fā)病率，即使是同一個(gè)基因的不同突變形式也可能通過(guò)不同的信號(hào)通路發(fā)生作用，產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能。

綜上所述，在體外實(shí)驗(yàn)中rhWISP3顯著促進(jìn)了Ⅱ型膠原的表達(dá)，這種促表達(dá)的作用可能是通過(guò)獨(dú)立于IGF－1信號(hào)通路而產(chǎn)生的，但SEDT－PA的具體發(fā)病機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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