辣椒素抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的實驗研究

黃媛媛

胰腺癌是一種惡性程度非常高的消化道腫瘤，早期診斷率低，中位生存期短［1，2］。吉西他濱作為晚期胰腺癌化療的標準藥物，在臨床應用中療效有限，根治術后輔助用藥的中位生存時間僅為22．1個月［3，4］。同時有研究表明吉西他濱無明顯抗胰腺癌轉移的作用［5］。多藥聯合的化療方案不但不能明顯延長患者生存時間，而且增加了化療的不良反應［6］。因此，這為臨床上胰腺癌的治療提出了嚴峻挑戰:即尋求新的藥物能有效抑制胰腺癌腫瘤生長從而更為有效治療胰腺癌。傳統中藥在中國的基本醫療保健中占有重要地位，近年來，傳統中藥被廣泛用于抗腫瘤的研究當中，是研發新的抗癌藥物的熱點［7］。辣椒素(capsaicin)，其結構為反式8－甲基－N－香草基－丁－壬烯胺，是紅辣椒中的一種活性成分。于1999年載入美國《藥典》。研究表明，辣椒素可以通過抑制HeLa細胞增殖，有報道稱辣椒素可以抑制前列腺癌裸鼠模型新生腫瘤的生長，另外Kim的研究發現辣椒素可以導致人結腸癌Ht－29細胞的凋亡［8～10］。然而辣椒素是否具有抑制胰腺癌細胞移植瘤增殖的效果目前尚不明了。

本實驗在裸鼠移植瘤模型基礎上研究辣椒素抑制胰腺癌腫瘤生長作用，探索其體內抗腫瘤的合適劑量，并探討其分子機制。

材料與方法

1．藥物和試劑:辣椒素(capsaicin，純度＞99%)購于美國Sigma公司，溶解于DMSO濃度＜0．1%的生理鹽水中。吉西他濱(gemcitabine)購于法國禮來公司，溶于生理鹽水。Trizol試劑購于Invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購于Fermentas。兔抗人XIAP多克隆抗體購于美國Abcam公司，兔抗人NF－κB抗體購于美國Abcam公司。

2．細胞培養和實驗動物:人胰腺癌細胞株BXPC－3購自美國組織培養庫(ATCC)。細胞培養于37℃含5%CO2的培養箱中。使用添加有10%胎牛血清并100U/m l青霉素和100U/m l鏈霉素的DMEM培養基進行細胞培養，待貼壁生長至70%～80%時使用胰蛋白酶(GIBCO，USA)消化傳代。6～8周齡BALB/c nu/nu雄性裸小鼠，體重20～22g，購于中國科學院上海實驗動物中心。飼養于SPF屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在25±1℃，相對濕度40% ～60%。免疫缺陷裸鼠所用的食物、水、墊料均經過滅菌處理。

3．模型建造和實驗方案:待細胞生長至對數期，用胰蛋白酶對其進行消化，用含10%胎牛血清的培養基進行中止消化并離心。離心后棄上清并用不含血清的1640培養基對細胞進行洗滌。再次離心后將細胞混勻于無血清的DMEM培養基中。將細胞懸液注射于裸鼠背部靠近后肢部位的皮下，每只注射約5×106個細胞。2周后，待腫瘤體積達到大約100mm3時，將裸鼠隨機分成4組，分別為對照組(N，生理鹽水)、吉西他濱組(GEM，100mg/kg)、低劑量組(辣椒素，10mg/kg)和高劑量組(辣椒素20mg/kg)，每組8只。分組當天開始腹腔注射給藥，3天1次，共8次。末次用藥1周后處死裸鼠。用藥前稱量裸鼠體重并測量腫瘤短徑和長徑a和b，處死裸鼠前稱量裸鼠體重并腫瘤長短經。腫瘤體積計算公式按照v=π/6×a2×b，a為長徑，b為短徑［11］。末次用藥1周后用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，取腫瘤組織稱重。取部分組織置于4%多聚甲醛固定，石蠟切片后做免疫組化染色。留取部分新鮮組織保存于液氮中做RT－PCR。

4．免疫組織化學染色法檢測NF－κB、XIAP和Ki－67:免疫組織化學檢測凋亡抑制蛋白XIAP，核轉錄因子NF－κB和細胞增殖因子Ki－67。對制備的各組標本進行連續切片，所得石蠟切片進行常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0．3%H2O2封閉，微波抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10min;兔抗人 XIAP抗體(稀釋度1∶600)，NF－κB抗體(稀釋度1∶500)，Ki－67抗體(1∶300)4℃孵育過夜，PBS 洗滌后滴加HRP標記的二抗37℃ 30min，DAB顯色3～5min，沖洗后蘇木素復染，流水沖洗返藍后脫水封片鏡檢。

5．總RNA提取及RT－PCR:(1)RNA提取:每塊標本稱取50～100mg置于液氮冷卻的研缽中，加液氮后進行研磨，在磨碎的標本中加入1m l Triol試劑繼續研磨;將磨好的組織移入到1．5ml的去酶EP管中，顛倒混勻30下，室溫5min;加氯仿0．2ml，顛倒混勻 30 下，室溫 10min;4℃，離心 12000r/min，15min;轉上層水相約(400μl)于另一1．5m l EP管中，加等體積異丙醇，混勻，室溫 10min;4℃，離心 12000r/min，10min，可見膠樣物質于管壁;移去上清，加入預冷的DEPC水配制75%乙醇1ml，震蕩后4℃離心7500r/min，5min;棄上清，超凈臺風機干燥10min，溶于20μl DEPC水中;紫外分光光度計測定RNA含量，并測定A260/A280值判斷RNA質量。(2)cDNA合成:按照說明書的步驟，向經核酸酶處理的離心管中，依次加入:①總RNA 5μg;②隨機引物1μl;③去除核酸酶的水，使總體積達到12μl;④5×反應緩沖液4μl;⑤RibolockTMRNase抑制劑(20U/μl)1μl;⑥10mmol/L dNTP 混合物 2μl;⑦RevertAidTMM－MuLV反轉錄酶(200U/μl)1μl。最終配成總體積為20μl的反應體系。然后將液體輕輕混勻后離心。按下面的溫度和時間條件進行孵育:25℃ 5min，42℃ 60min，70℃5min。將所得產物直接擴增或置于－20℃短期保存。(3)引物:NF－κB和XIAP引物設計和合成均由上海捷瑞公司提供。所有引物序列和產物大小如表1所示。(4)PCR擴增:向每個PCR反應管中依次加入:模板RNA1μl;上下游引物(濃度為10μmol/L)各1μl，所用引物序列如表1所示;2×Master Mix 12．5μl，然后加 ddH2O 10．5μl。將混合物混勻后離心，置于Biorad(美國)擴增儀中進行擴增。取5μl擴增產物置于0.5%瓊脂糖凝膠電泳并成像。

表1 RT－PCR所用的引物序列

6．統計學方法:應用Gel Pro3．2軟件分析PCR電泳圖像，應用 IPP(image－pro Plus 6．0，media cybernetics，silver spring，MD)軟件分析免疫組化圖片。實驗數據采用均數±標準差(x±s)。所有數據采用SPSS 17．0軟件ANOVA單因素方差分析，組與組之間比較采用S－N－K檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．各組腫瘤體積和裸鼠質量的變化:裸鼠隨機分組當天各組的腫瘤平均體積為123．3±7．6mm3，各組裸鼠平均體重為21．6±1．1g，差異均無統計學意義。末次用藥后1周，對照組瘤體平均體積為578．7±91.2mm3;低劑量辣椒素組的瘤體平均體積為375．8±35．2mm3，吉西他濱組的瘤體平均體積為344．3±22.5mm3，高劑量辣椒素組的瘤體平均體積為244．9±32．5mm3。與對照組相比，低劑量辣椒素組與吉西他濱組的瘤體平均體積均明顯小于對照組 (P＜0.05)，但高劑量辣椒素抑制腫瘤的作用更為明顯，與其他各組相比，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2．辣椒素降低 NF－κB、XIAP和 Ki－67的表達量:應用IPP軟件對免疫組化圖片進行分析，各組腫瘤組織中NF－κB和P－gp蛋白的表達量以累積光密度值的形式表示。各組累積光密度值為:NF－κB，N 組(6634±372)，G 組(7123±271)，L－CAP組(5322±79)，H－CAP組(3883±126)，與對照組和吉西他濱組相比，低劑量和高劑量辣椒素組可顯著下調NF－κB的表達量，差異有統計學意義(P＜0.05)。XIAP，N 組(3887±337)，GEM組(4347±67)，L－CAP組(3122±121)，H －CAP組(1215±106)，與其他各組相比，低劑量和高劑量辣椒素組可顯著下調XIAP的表達量，差異均有統計學意義(P＜0．05)。各組中Ki－67表達量的變化(圖1):在400倍光鏡下隨機選擇10個視野，Ki－67增殖指數按以下公式計算:Ki－67陽性細胞數/細胞總數×100%。結果顯示:與對照組相比(63.0±3.2)，低劑量辣椒素組 Ki－67 表達量(44．0 ±2．6)顯著下降(P ＜0．05);H －CAP組(21．0±1．2)與GEM組(35．0±1．4)相比，差異有統計學意義(P＜0．05)。高劑量辣椒素抑制細胞增殖因子Ki－67的表達的效果更顯著，與其他各組比較，差異有統計學意義(P ＜0．05)。

圖1 免疫組化法檢測各組裸鼠瘤體中NF－κB、XIAP和K i－67的表達(×400)

3．辣椒素對NF－κB和XIAPmRNA的表達的影響:辣椒素可以顯著下調NF－κB和XIAPmRNA的表達量(圖2)。與其他各組相比，低劑量和高劑量辣椒素組NF－κB mRNA的表達量顯著下降，差異均有統計學意義(P＜0．05);與其他兩組相比低劑量和高劑量辣椒素組XIAPmRNA的表達量顯著下降，差異均有統計學意義(P＜0．05)。

討 論

核轉錄因子NF－κB是一種重要的生物分子，它參與細胞的多種生理病理過程，包括免疫反應、免疫耐受、炎癥反應、細胞增殖以及細胞凋亡、腫瘤形成等［12］。因此，一些以NF－κB為分子靶點的抗腫瘤研究取得了一定的進展，Patel等［13］報道辣椒素可以通過抑制NF－κB的活性減少惡性黑色素瘤的增殖。本課題在前人應用辣椒素抗癌的研究的基礎上，探討辣椒素對胰腺癌的抗腫瘤作用，研究結果顯示，在基因和蛋白水平，對照組和吉西他濱組NF－κB均呈高表達，而低劑量和高劑量辣椒素組，其表達量均下降。辣椒素可以抑制NF－κBmRNA和蛋白的表達，導致核轉錄因子NF－κB表達量下降。

圖2 各組腫瘤中NF－κB和XIAPm RNA的表達量的變化

細胞凋亡是細胞的程序性死亡，腫瘤細胞中凋亡抑制蛋白的過量表達是其惡性增殖的原因之一，當某種因素引起細胞的凋亡紊亂時就會發生腫瘤。介導細胞的凋亡的信號通路有兩種:線粒體通路和死亡受體通路，而胱天蛋白酶家族(caspases)是貫穿于這兩條通路的關鍵分子，他們在細胞凋亡過程中發揮重要的作用。XIAP就是一種凋亡抑制蛋白，它可以通過直接與 caspase－3、caspase－7和 caspase－9結合，從而抑制細胞凋亡［14］。研究表明，NF－κB和XIAP的高表達是腫瘤產生耐藥的原因之一，通過降低二者的表達量可以有效逆轉腫瘤的耐藥性，從而增強化療效果［15］。在吉西他濱化療后，胰腺癌組織中 NF－κB和XIAP的表達量均增高，而通過聯合中藥大黃素后下調二者的表達量可以增強吉西他濱的化療效果［15］。另有報道稱通過下調NF－κB的表達量和抑制其轉錄活性可以抑制mdr1基因的表達，最終使P－gp的表達量和功能下降，從而達到逆轉乳腺癌細胞系MCF－7的化療耐藥。本課題研究結果顯示，對照組和吉西他濱組NF－κB和XIAP均呈高表達，而低劑量和高劑量辣椒素組表達量顯著下降。辣椒素(capsaicin，反式8－甲基 －N－香草基 －丁 －壬烯胺)，作為食物和傳統藥物已有幾千年的歷史。裸鼠移植瘤動物模型研究顯示，高劑量辣椒素的腫瘤抑制作用明顯高于吉西他濱組和低劑量組。此現象提示，在體內實驗中，辣椒素具有確切的抗腫瘤效果，高劑量辣椒素(20mg/kg)的抗腫瘤效果優于低劑量辣椒素(10mg/kg)，其差異具有統計學意義(P＜0．05)。

總之，辣椒素具有抑制胰腺癌細胞裸鼠移植瘤增長的作用，其機制是通過抑制核轉錄因子NF－κB的表達，從而下調凋亡抑制蛋白XIAP的表達來實現的。

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