靶向性沉默DNMT1基因對胰腺癌細胞DNA甲基化的影響

徐岷 張尤歷 高道鍵 張玉琦 李兆申 高軍 杜奕奇 龔燕芳 吳洪玉 高飛

·論著·

靶向性沉默DNMT1基因對胰腺癌細胞DNA甲基化的影響

徐岷 張尤歷 高道鍵 張玉琦 李兆申 高軍 杜奕奇 龔燕芳 吳洪玉 高飛

目的觀察DNA甲基轉移酶1(DNMT1)基因沉默后對人胰腺癌PaTu8988細胞的DNMT活性及hMLH-1基因CpG島DNA甲基化狀態的影響。方法由美國Ambion公司設計合成DNMTl siRNA和陰性對照siRNA，分別用15、30 nmol/L的濃度轉染胰腺癌PaTu8988細胞，以未轉染組細胞作為對照。應用實時PCR和蛋白質印跡法檢測DNMT1 mRNA和蛋白的表達；用DNMT活性檢測試劑盒檢測其活性；用亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)法檢測hMLH-1基因CpG島的甲基化狀態；實時PCR法檢測hMLH-1 mRNA的表達。結果轉染48 h后，DNMT1 siRNA15、30 nmol/L組細胞DNMT1 mRNA表達量分別為0.573±0.026和0.143±0.044，顯著低于對照組的1.020±0.217及陰性siRNA 15、30 nmol/L組的0.900±0.475和0.938±0.327(P值均<0.05)；DNMT1 siRNA組的DNMT1蛋白表達亦低于對照組和陰性siRNA組。DNMT1 siRNA15、30 nmol/L組細胞DNMT活性分別為0.364±0.124和0.250±0.072，明顯低于對照組的0.931±0.065及陰性siRNA 15、30 nmol/L組的0.665±0.055和0.472±0.040。DNMT活性與DNMTl mRNA表達呈正相關(r=0.69，P<0.01)。DNMTl RNA干擾后導致hMLH-1基因CpG位點的8個甲基化減少到1個甲基化。結論DNMTl siRNA能特異性抑制胰腺癌PaTu8988細胞DNMTl 基因的表達，明顯抑制DNMT的活性，并引起hMLH-1基因CpG島去甲基化。

DNA甲基轉移酶l； RNA，小分子干擾； 胰腺腫瘤； 甲基化

DNA甲基化是重要的基因表觀修飾方式之一，是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉變為5′甲基胞嘧啶。DNMT1在哺乳動物細胞中是含量最多的DNMTs，主要起著維持DNA甲基化的作用。本實驗將DNMT1小分子干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)轉染人胰腺癌PaTu8988細胞，觀察DNMTl基因沉默后對細胞DNMT活性、hMLH-1 mRNA及其CpG島甲基化位點的影響。

材料和方法

一、細胞分組

人胰腺癌PaTu8988細胞系由德國Marburg市Philipps大學細胞生物學和分子病理學研究所Elsasser博士惠贈，常規培養、傳代。DNMTl siRNA(ID：110914)和陰性對照siRNA(陰性siRNA)由美國Ambion公司設計合成。DNMTl siRNA序列：正義鏈為5′-GGCGGCUCAAAGAUUUGGATT-3′，反義鏈為5′-UCCAAAUCUUUGAGCCGCCTG-3′。 取對數生長期細胞，分為對照組，陰性siRNA 15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組。待細胞生長至60%～70%時，采用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將不同濃度的陰性siRNA或DNMT1 siRNA轉染細胞，對照組僅加入等容積Opti-DMED培養液。培養6 h后更換為含10%小牛血清的DMEM繼續培養48 h，收集各組細胞，PBS洗3次。

二、DNMT1 mRNA、hMLH-1 mRNA表達的檢測

采用Trizol提取各組細胞的總RNA。實時PCR法檢測DNMT1 mRNA的表達。應用Primer5.0軟件設計引物，DNMT1引物：5′-GTGGGGGACTGTGTCTCTGT-3′和5′-TGAAAGCTGCATGTCCTCAC-3′，擴增片段204 bp；hMLH-1引物：5′-TCCCGAAAGGAAATGACTGC-3′和5′-CTCCGATAACCTGAGAAC-ACCAAA-3′，擴增片段279 bp；內參GAPDH引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′，擴增片段142 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR儀為7500型(美國Applied Biosystems公司)。擴增條件：95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共 40個循環。mRNA相對表達量(RQ)=2-ΔΔCT，實驗重復3次，取均值。以對照組mRNA表達量的均數為1，計算其他各組mRNA表達量的倍數。

三、DNMT1蛋白檢測

提取上述各組細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，取20 μg蛋白常規行蛋白質印跡法檢測DNMT1蛋白的表達。兔抗人DNMT1多抗(美國Abcom公司)1∶1000稀釋，HRP標記的羊抗兔二抗1∶2000稀釋，最后加入ECL反應液，暗室顯影、定影后掃描。以β -actin蛋白表達作為內參照。

四、DNMT活性檢測

按照核蛋白提取試劑盒(美國Epigentek公司)說明書提取各組細胞核蛋白，采用DNA甲基轉移酶活性檢測試劑盒(美國Epigentek公司)測定細胞核蛋白中DNMT活性，以吸光值表示。

五、hMLH-1基因CpG島的甲基化狀態檢測

采用酚/氯仿抽提法提取細胞總DNA，采用DNA甲基化試劑盒(美國Zymo Research公司)進行亞硫酸氫鹽處理。應用BSP法檢測hMLH-1基因CpG島的甲基化。參考文獻[1]設計引物，上游5′-GGAGTGAAGGAGGTTAYGGGTAAGT-3′，下游5′-AAAAACRATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3′，擴增產物182 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃ 3 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環，72℃ 10 min。PCR產物用2%瓊脂糖電泳進行鑒定，用膠回收試劑盒(維特潔公司)回收及純化PCR產物，并插入pMD-18T載體(日本TAKARA公司)，送上海美季生物公司測序。

六、統計學處理

結 果

一、各組細胞DNMTl mRNA及蛋白的表達

對照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細胞的DNMT1 mRNA相對表達量分別為1.020±0.217、0.900±0.475、0.938±0.327、0.573±0.026和0.143±0.044。對照組與陰性siRNA組之間差異無統計學意義(P>0.05)；DNMT1 siRNA組顯著低于其他各組(P值均<0.05)，且其30 nmol/L組更顯著低于DNMT1 siRNA 15 nmol/L組(t=3.692，P<0.05)。

各組DNMT1蛋白表達變化同mRNA的表達(圖1)。

圖1 各組細胞DNMT1蛋白的表達

二、各組細胞DNMT活性的變化及其與DNMTl mRNA表達的相關性

對照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細胞DNMT活性的吸光值分別為0.931±0.065、0.665±0.055、0.472±0.040、0.364±0.124和0.250±0.072；抑制率分別為(0.00±6.96)%、(28.61±5.88)%、(49.27±4.29)%、(60.90±13.29)%和(73.15±7.77)%，依次逐漸增加，兩兩組間的抑制率差異均有統計學意義(P<0.05)。DNMT活性與DNMTl mRNA表達呈正相關(r=0.69，P<0.01，圖2)。

三、各組細胞hMLH-1 mRNA表達及CpG島的甲基化狀態

對照組，陰性siRNA15、30 nmol/L組，DNMTl siRNA 15、30 nmol/L組細胞的hMLH-1 mRNA表達量分別為1.012±0.241、0.986±0.325、1.021±0.303、3.264±0.617和5.733±0.847。對照組與陰性siRNA組之間差異無統計學意義(t=0.011，P>0.05)；DNMT1 siRNA組顯著高于其他各組(P值均<0.05)，且其30 nmol/L組更顯著高于15 nmol/L組(t=4.08，P<0.05)。擴增的hMLH-1基因CpG島的DNA包含22個CpG位點，RNA干擾后導致hMLH-1基因CpG位點的8個甲基化減少到1個甲基化(圖3)。

圖2 DNMTl mRNA表達與DNMTl活性的相關性

黑點表示甲基化的CpG位點，黑圈表示非甲基化的CpG位點

圖3RNA干擾后各組hMLH-1基因CpG島的甲基化狀況

討 論

腫瘤的發生與多種基因的異常甲基化密切相關，包括抑癌基因、DNA損傷修復基因及與腫瘤代謝和浸潤相關的基因。腫瘤組織中的DNA甲基化異?？偟奶卣鳛閺V泛低甲基化伴局部高甲基化[1]。通常情況下，DNA高甲基化不僅可以直接或間接影響基因轉錄，也可導致C-T突變而引起基因表達異常，導致細胞惡變，最終形成腫瘤[2-3]。DNA的去甲基化與轉錄的啟動、基因活化和行使功能有關，因此針對DNA去甲基化的治療是治療腫瘤的新途徑。

Robert等[4]研究發現，無論使用反義核苷酸還是siRNA選擇性沉默DNMT1表達，均能明顯降低結腸癌HCT116、SW48和SW480細胞的DNMT的活性，并引起細胞總體甲基化水平下降。Ting等[5]研究發現，沉默DNMT1基因后，結腸癌SW48細胞、膀胱癌T24細胞內仍維持了DNA高甲基化狀態。但在乳腺癌細胞中干擾DNMT1 基因，甲基化轉移酶的活性降低90%。然而，Rhee等[6-7]靶向性沉默DNMT1基因只能引起結腸癌HCT116細胞總體甲基化水平下降20%，不能有效引起抑癌基因的重新表達。而同時沉默DNMT1和DNMT3b基因表達，可以引起細胞總體甲基化水平下降95%，許多抑癌基因重新表達，有效抑制細胞生長。Sowinska等[8]構建了穩定表達沉默DNMT1和(或)DNMT3b基因的乳腺癌MCF-7細胞和胰腺癌AsPC1細胞，分別引起甲基化水平下降59%、57%、45%和38%，聯合干擾兩個基因可引起CXCL12啟動子CpG島甲基化水平下降75%和68%。Leu等[9]研究發現，聯合沉默DNMT1和DNMT3b基因可抑制卵巢癌細胞的生長，其效果明顯強于單獨沉默DNMT3b基因；聯合兩種siRNA干擾引起癌細胞去甲基化的作用亦明顯強于單獨沉默DNMT1或DNMT3b基因。

本研究結果顯示，DNMT1 siRNA可以高效、特異性地抑制DNMT1基因的表達，同時DNMT活性抑制率達60%以上，DNMT活性與DNMTl mRNA表達呈正相關，支持DNMT1在DNMT活性中占主導作用的觀點，與其他部分研究結果一致[4-6]。

Robert等[4]研究發現，靶向性沉默DNMT1基因能明顯降低結腸癌HCT116、SW48和SW480細胞內抑癌基因CDKN2A的去甲基化和基因表達增加。Jung等[10]使用siRNA靶向性沉默DNMT1基因，可引起CDKN2A、RASSF1A等抑癌基因去甲基化和重新表達。Ting等[5]研究發現，沉默DNMT1基因后，乳腺癌細胞中Cdkn2a、Sfrp1和Gata4基因的啟動子發生去甲基化，基因表達增加。Suzuki等[11]通過沉默DNMT1基因可以使非小細胞肺癌NCI-H1299和乳腺癌HCC1954細胞的RASSF1A、p16ink4A、CDH1和HPP1基因啟動子的甲基化水平降低80%，并使這些基因重新表達。提示DNMT1基因也可通過調

控hMLH-1基因的甲基化狀態，進而影響細胞的增殖。人類錯配修復基因1(hMLH-1)是與細胞增殖有關的一個基因。本研究結果顯示，沉默DNMT1基因后hMLH-1 mRNA表達增加，其啟動子的CpG島呈現去甲基化狀態，與上述研究結果類似。

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EffectsofDNAmethyhransferase1genesilencingonDNAmethylationofpancreaticcancer

XUMin,ZHANGYou-li,GAODao-jian,ZHANGYu-qi,LIZhao-shen,GAOJun,DUYi-qi,GONGYan-fang,WUHong-yu,GAOFei.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

Correspondingauthor:GAOFei,Email：soar1999@163.com

ObjectiveTo assess the effects of DNA methyhransferase 1 (DNMT1) gene silencing on DNMTs activity and methylated CpG sites of hMLH-1 in pancreatic cancer cell line PaTu8988.MethodsDNMTl siRNA and negative control siRNA was constructed by Ambion Company of United States. Then they were transfected into pancreatic cancer cell line PaTu8988 at the concentrations of 15, 30 nmol/L, and the cells without transfection was used as the control group. Real-time PCR and Western blotting were applied to detect the DNMTl mRNA and protein expression, and DNMTs activity was detected by using DNMTs activity assay kit. Change of methylation of CpG island of hMLH-1 was detected by bisulfite sequencing PCR (BSP). The expression of hMLH-1 mRNA was detected by Real-time PCR.ResultsAt 48 h after transfection, Real-time RT-PCR analysis showed that the levels of DNMT1 mRNA in DNMT1 siRNA group (15 nmol/L) and DNMT1 siRNA group (30 nmol/L) were 0.573±0.026and0.143±0.044，which were significantly lower than those in control group 1.020±0.217 and negative siRNA 15 nmol/L group 0.900±0.475, and negative siRNA 30 nmol/L group 0.938±0.327(P<0.05). Western blotting analysis showed that the level of DNMT1 protein of DNMT1 siRNA group was also lower than those of negative siRNA and control groups. DNMT activity in DNMT1 siRNA15, 30 nmol/L groups was 0.364±0.124and0.250±0.072, which were significantly lower than those in control group 0.931±0.065and negative siRNA group 0.665±0.055 and 0.472±0.040.DNMT activity was positively correlated with DNMTl mRNA expression (r=0.69，P<0.01). DNMTl RNA interference decreased 8 methylated CpG sites of hMLH-1 to 1 site.ConcluslonsDNMTl siRNA can specifically inhibit the expression of DNMTl gene of PaTu8988 and DNMT activity, and can decrease methylated CpG sites of hMLH-1 gene.

DNA methyhransferase 1 (DNMT1); RNA，small interfering; Pancreatic neoplasms; Methylation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.006

江蘇省自然科學基金(BK2009210)；江蘇省衛生廳科研項目(H200836)；遼寧省博士科研啟動基金(20101131)；鎮江市科研計劃項目(SH2009012)

212001 江蘇鎮江，江蘇大學附屬醫院消化科(徐岷、張尤歷)；第二軍醫大學長海醫院消化科(高道鍵、張玉琦、李兆申、高軍、杜奕奇、龔燕芳、吳洪玉)；沈陽軍區總醫院內窺鏡科(高飛)

高飛，Email：soar1999@163.com

2011-11-16)

(本文編輯：呂芳萍)