p38MAPK抑制劑對大鼠急性壞死性胰腺炎合并肺損傷的保護作用

許永春 劉楓 龔燕芳 金晶 李兆申

·論著·

p38MAPK抑制劑對大鼠急性壞死性胰腺炎合并肺損傷的保護作用

許永春 劉楓 龔燕芳 金晶 李兆申

目的探討p38MAPK特異性抑制劑SB203580對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠合并肺損傷的保護作用。方法54只雄性SD大鼠按數字表法隨機分為對照組、ANP組和SB203580(干預)組，每組18只。以左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立大鼠ANP模型，對照組大鼠腹腔注射等容積生理鹽水，干預組在制模前腹腔注射SB203580(用二甲基亞楓溶解配制成10 μmol/L)5 mg/kg體重。術后3、6、12 h分批處死大鼠，取血測淀粉酶、TNF-α和IL-6含量，行胰腺及肺組織病理學檢查，計算肺組織濕/干重比，測髓過氧化酶(MPO)含量，RT-PCR法檢測中性粒細胞趨化因子(CINC) mRNA表達，蛋白質印跡法檢測磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白表達。結果術后6 h，對照組的血淀粉酶、TNF-α和IL-6含量、肺組織濕/干重比、MPO活性、CINC mRNA及p-p38MAPK蛋白表達量分別為(1035±73)U/L、(0.94±0.16)μg/L、(4.77±0.86)μg/L、3.92±0.29、(0.39±0.02)U/g、0.28±0.04、0.09±0.04；ANP組分別為(5848±656)U/L、(3.84±0.32)μg/L、(103.54±15.32)μg/L、4.97±0.47、(1.03±0.08)U/g、0.62±0.06、0.52±0.14；干預組分別為(4259±286)U/L、(1.64±0.21)μg/L、(76.56±11.46)μg/L、4.32±0.34、(0.78±0.05)U/g、0.37±0.04、0.27±0.08。ANP組的各項指標均顯著高于對照組，干預組的各項指標均顯著低于ANP組，但仍顯著高于對照組(P值均<0.01)。結論SB203580可通過阻斷p38MAPK信號通路，在一定程度上減少炎癥因子的產生，減輕ANP大鼠胰腺及肺組織損傷。

胰腺炎，急性壞死性； p38絲裂原活化蛋白激酶； SB203580； 急性肺損傷

急性壞死性胰腺炎(ANP)易并發急性肺損傷(acute lung injury，ALT)，甚至發展至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，體內大量炎癥介質、細胞因子的釋放在其發病機制中起重要作用。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路是控制炎癥反應最主要的MAPK家族成員之一，它在細胞核內通過磷酸化作用激活許多轉錄因子，調節炎癥介質的產生。本研究應用p38MAPK特異性抑制劑SB203580干預ANP大鼠，觀察其對ANP相關肺損傷的保護作用。

材料與方法

一、動物分組及模型制作

健康雄性SD大鼠54只，體重200～250 g，上海第二軍醫大學實驗動物中心提供。按數字表法隨機分為對照組、ANP組、干預組。采用腹腔注射15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重2次、間隔1 h的方法制備ANP模型。干預組于制模前腹腔注射p38MAPK特異性抑制劑SB203580 5 mg/kg體重。對照組大鼠腹腔分兩次注射等容積無菌生理鹽水。術后3、6、12 h分批處死大鼠各6只，腹主動脈取血，離心取血清，-80℃保存；取胰腺、肺組織置4%多聚甲醛固定。

二、方法

1．血淀粉酶、TNF-α、IL-6檢測：采用酶法通過HITACHI-7150型自動生化分析儀檢測血淀粉酶；采用ELISA法檢測血TNF-α、IL-6。

2．肺濕/干重比測定：取部分肺組織，用濾紙拭凈血跡后稱濕重，再置60℃烤箱內烘烤48 h，稱干重，以肺濕/干重比反映肺水腫程度。

3．肺組織髓過氧化酶(MPO)活性測定：應用南京建成生物工程研究所MPO檢測試劑盒檢測。每克肺組織濕片在37℃的反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個酶活力單位。MPO活性=△A460/[11.3×肺重量(g)]。

4．胰腺及肺組織病理學檢查：取胰腺和肺組織常規固定，脫水，石蠟包埋，HE染色,由病理醫師閱片。

5．肺組織中性粒細胞趨化因子(CINC) mRNA表達檢測：以Trizol試劑抽提肺組織總RNA。CINC引物上游5′-GCTCGCTTCTCTGTGCAGC-3′，下游5′-CCATCGGTGCAATCTATCTTC-3′,擴增片段304 bp；內參β-actin引物上游5′-AGGGTGTGATGGTGG-GTATG-3′，下游5′-CATAGCTCTTCTCCAGGGAG-3′， 擴增片段600 bp。RT-PCR條件：37℃ 90 min；95℃ 2 min， 95℃ 15 s、62℃(CINC)或55℃(β-actin)15 s、72℃ 15 s， 40個循環，最后72℃ 10 min。擴增產物經電泳分離，凝膠圖像掃描儀掃描，以CINC與β-actin條帶灰度比值作為CINC mRNA相對表達量。

6．肺組織磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)表達檢測：采用蛋白質印跡法檢測。羊抗大鼠p-p38MAPK多抗1∶200稀釋。結果以條帶的灰度值表示。

三、統計學分析

結 果

一、血淀粉酶、TNF-α、IL-6水平的變化

ANP組大鼠血淀粉酶、TNF-α、IL-6水平均顯著高于對照組(P<0.01)；干預組較ANP組明顯降低(P值均<0.01)，但仍顯著高于對照組(P值均<0.01，表1)。

二、肺濕/干重比、MPO含量變化

ANP組大鼠肺濕/干重比、MPO含量值均顯著高于對照組(P值均<0.01)；干預組較ANP組明顯降低(P值均<0.01)，但仍高于對照組(P值均<0.01，表1)。

表1 各組大鼠血淀粉酶、TNF-α、IL-6水平及肺濕/干重比、MPO值的變化

注：與對照組同時點比較，q值為4.51～37.58，aP<0.01 ；與ANP組同時點比較，q值為4.32～11.20，bP<0.01

三、胰腺和肺組織學變化

對照組胰腺組織正常；ANP組胰腺間質水腫，小葉間隙增大，炎細胞浸潤，腺泡腫脹、小葉結構破壞，胰腺組織片狀壞死，血管破裂出血；干預組胰腺間質水腫，伴中等量炎細胞浸潤，胰腺腺泡有少量破壞，胰腺組織壞死少見，或胰腺腺泡和導管基本正常，未見血管破裂出血。

對照組肺組織結構清晰，肺泡壁完整，間質無水腫滲出；ANP組肺間質增寬、充血水腫、炎細胞浸潤，可見間質、肺泡腔出血；干預組肺間質增寬、充血水腫，見炎細胞浸潤，肺泡腔未見出血(圖1)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)、干預組(c)大鼠肺組織病理學變化(HE ×100)

四、肺組織CINC mRNA的表達

對照組肺組織CINC mRNA表達量為0.28±0.04；ANP組6 h時的肺組織CINC mRNA表達量為0.62±0.06，較對照組顯著增加，差異具有統計學意義(P<0.01)；干預組6 h時的肺組織CINC mRNA表達量為0.37±0.04，較ANP組同時間點顯著減少(P<0.01)，但仍顯著高于對照組(P<0.01，圖2)。

五、各組大鼠肺組織p-p38 MAPK蛋白的表達

對照組肺組織p-p38 MAPK蛋白的表達量為0.09±0.04；ANP組6 h時為0.52±0.14，較對照組顯著增加(P<0.01)；干預組6 h時表達量為0.27±0.08，較ANP組同時間點顯著減少(P<0.01)，但仍顯著高于對照組(P<0.01，圖3)。

1：對照6 h組；2：干預6 h組；3：ANP 6 h組；4：Marker

圖2肺組織中CINC mRNA的表達

圖3 各組肺組織p-p38 MAPK蛋白表達

討 論

在ANP并發急性肺損傷過程中，TNF-α是起始和中軸因子， IL-6是繼發于TNF-α和IL-1之后釋放的多肽因子，在ANP發生中刺激肝臟合成C反應蛋白，與TNF-α和IL-1協同作用促使全身炎癥發應綜合征(SIRS)的發生。CINC是一類主要由單核-巨噬細胞產生的中性粒細胞趨化因子，可以導致中性粒細胞的大量激活、遷徙并聚集于肺部，在ANP并發急性肺損傷中起著極為重要的作用。TNF-α和IL-6等是CINC分泌的誘導劑，CINC出現在級聯反應的遠端，繼發于TNF-α和IL-1之后出現峰值[1-8]。

p38MAPK通路是控制炎癥反應最主要的MAPK家族成員之一，p38MAPK的激活能促進單核巨噬細胞產生TNF-α、IL-1、IL-6、CINC等炎性因子，介導中性粒細胞的活化，促進中性粒細胞炎性聚集[9-11]。本實驗結果顯示，誘發ANP后3 h，TNF-α和IL-6水平即迅速升高，而肺組織CINC表達增加較緩慢，峰值在6 h，提示CINC表達增加與TNF-α和IL-1的誘導有關，與文獻報道一致[12]。

SB203580通過阻斷p38MAPK信號途徑，抑制TNF-α、IL-6的分泌和CINC的表達。本實驗結果顯示，應用p38MAPK特異性抑制劑治療實驗性ANP能顯著降低大鼠血TNF-α、IL-6水平，顯著下調肺組織CINC的表達，降低肺組織內MPO水平，減少白細胞的浸潤，減輕肺組織的病理損傷，對ANP并發的肺損傷有保護作用，提示p38MAPK通路有可能成為臨床預防和治療急性胰腺炎相關肺損傷的新途徑。

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Protectiveeffectsofp38MAPKinhibitoronacutenecrotizingpancreatitisassociatedlunginjuriesinrats

XUYong-chun,LIUFeng,GONGYan-fang,JINJing,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,The94thHospitalofPLA,Nanchang330002,China

Correspondingauthor:LIZhao-shen，Email:lizhaoshen@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the protective effects of p38MAPK inhibitor SB203580 on acute necrotizing pancreatitis associated lung injuries in rats.MethodsFifty-four SD male rates were randomly divided into 3 groups, including control group, ANP group, SB203580 group with 18 rats in each group. ANP was induced by intraperitoneal injection of L-arginine solution. Rats in control group were intraperitoneally injected with same amount of saline. Before ANP induction, the rats in SB203580 group

10 μmol/L SB203580 dissolved by dimethyl sulfoxide at a dose of 5mg/kg weight via intraperitoneal injection. The rats were sacrificed at 3, 6, and 12 h after operation, the serum levels of amylase, TNF-α, IL-6 was determined. Pathological changes of pancreas and lung were observed. The wet/dry (W/D) weight ratio of lung and MPO were measured. CINC mRNA of lungs was determined by RT PCR. Expression of phosphated-p38MAPK (p-p38MAPK) protein was evaluated by Western blotting.ResultsThe serum levels of amylase, TNF-α, IL-6 and wet/dry (W/D) weight ratio of lung, MPO activity , CINC mRNA and p-p38MAPK protein expression of lungs were (1035±73)U/L, (0.94±0.16)μg/L, (4.77±0.86)μg/L, 3.92±0.29, (0.39±0.02)U/g, 0.28±0.04,0.09±0.04 in control group at 6 h after operation, and the corresponding values were (5848±656) U/L, (3.84±0.32)μg/L, (103.54±15.32)μg/L,4.97±0.47, (1.03±0.08) U/g, 0.62±0.06, 0.52±0.14 in ANP group, while they were (4259±286) U/L, (1.64±0.21)μg/L, (76.56±11.46)μg/L,4.32±0.34, (0.78±0.05)U/g, 0.37±0.04, 0.27±0.08 in SB203580 group. The values in ANP group were significantly higher than those in control group, and the values in SB203580 group were significantly lower than those in ANP group, but they were still significantly higher than those in control group (P<0.01).ConclusionsSB203580 may attenuate injury of lung and pancreas in ANP by blocking p38MAPK signal transduction pathway, and decreasing the production of inflammatory cytokines.

Pancreatitis，acute necrotizing； p38 mitogen-activatal protein kinase； SB203580； Acute lung injury

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.012

全軍醫藥衛生科研基金資助(08MA064)

330002 南昌，解放軍第九四醫院消化內科(許永春)；第二軍醫大學長海醫院消化科(劉楓、龔燕芳、金晶、李兆申)

李兆申，Email:lizhaoshen@yahoo.com

2012-02-21)

(本文編輯：屠振興)

本刊2012(2)期作者楊立新的論文“抑癌基因ppENK甲基化在胰腺癌發病機制中的作用”做如下修正：

1．作者單位為北京協和醫院消化科(第一作者現在首都醫科大學附屬北京朝陽醫院消化科)

2．該課題由國家自然科學基金(81072055)和衛生部臨床學科重點項目資助