沉默小鼠成纖維細胞活化蛋白表達對原代胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響

邵葉波 靳大勇 戎葉飛 許雪峰

·論著·

沉默小鼠成纖維細胞活化蛋白表達對原代胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響

邵葉波 靳大勇 戎葉飛 許雪峰

目的應用RNA干擾技術沉默小鼠胰腺癌相關成纖維細胞的成纖維活化蛋白(FAP)表達，觀察其對小鼠原代胰腺癌細胞增殖及凋亡的影響。方法構建靶向小鼠FAP基因的重組表達質粒siFAP及對照質粒siMOCK，分別轉染小鼠原代胰腺癌相關成纖維細胞mPCa-FCs-1212，采用定量RT-PCR法及蛋白質印跡法檢測轉染細胞的FAP mRNA及蛋白表達。將該細胞與小鼠原代胰腺癌細胞mPCa-1212按1∶1的比例共培養，應用MTT比色法檢測mPCa-1212細胞的增殖抑制率，應用Annexin V-FITC/PI染色及流式細胞儀檢測細胞凋亡。結果轉染重組質粒siFAP的mPCa-FCs-1212細胞的FAP mRNA及蛋白表達較轉染對照質粒siMOCK的細胞的表達明顯下調[0.584±0.029比1.052±0.281，P=0.0213；(27.18±3.23)%比(61.58±4.72)%，P=0.0317]。轉染siFAP和轉染siMOCK的mPCa-FCs-1212分別與mPCa-1212細胞共培養3 d后，mPCa-1212的增殖抑制率分別為(23.02±3.32)%和(1.11±0.23)%；細胞凋亡率分別為(42.31±5.34)%和(7.38±2.09)%，兩組細胞的差異具有統計學意義(P= 0.000)。結論沉默FAP基因的mPCa-FCs-1212在體外可有效抑制mPCa-1212細胞的增殖，誘導細胞凋亡，可能是一種潛在的基因治療新方法。

RNA，小分子干擾； 基因沉默； 成纖維細胞活化蛋白； 胰腺腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡

成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)是一種僅在惡性上皮腫瘤間質中表達的Ⅱ型膜抗原，其可促進腫瘤細胞的增殖和轉移[1]。我們前期成功構建了FAP的真核表達載體，并驗證其在C57BL/6小鼠體內外均可順利表達[2]。本研究采用RNA干擾(RNA interfernce，RNAi)技術沉默小鼠胰腺癌相關成纖維細胞(mPCa-FCs-1212)FAP基因，觀察其對小鼠原代胰腺癌細胞(mPCa-1212)的增殖和凋亡的影響。

材料與方法

一、siRNA載體的構建

[3]所示的序列和方法，采用化學合成法合成針對小鼠FAP基因的shRNA。它的單鏈DNA模板組成元件為5′端的BamHⅠ酶切位點+siRNA靶向沉默序列+環狀結構序列TTGATATCCG+siRNA反向互補序列+U6啟動子終止序列TTTTTT+3′端的HindⅢ酶切位點。靶向FAP的siRNA(siFAP)序列為5′-AAGCTCTGGCGATATTCATAC-3′；陰性對照的隨機siRNA(siMOCK)序列為5′-CTACCGTTGTTATAGGTGT-3′。 引物由上海生工生物工程公司合成。先將正、反向寡核苷酸序列經95℃加熱、退火至室溫，獲得雙鏈siRNA插入片段，將siFAP、siMOCK插入片段、質粒pRNAT-U6.1/Neo分別進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產物經過凝膠回收試劑盒(博大泰克公司)回收純化后，于16℃連接過夜，然后轉化大腸桿菌感受態DH5α，取100 μl菌液涂布于氨芐青霉素抗性的選擇性培養基平板，置37℃培養過夜。分別挑選出含有siFAP及siMOCK重組子pRNT-U6-siFAP、pRNT-U6-siMOCK的大腸桿菌克隆，經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切及DNA測序驗證。DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

二、細胞轉染、篩選以及與mPCa-1212細胞共培養

mPCa-FCs-1212細胞為中山醫院普外科中心實驗室保存，常規培養、傳代。當細胞豐度達到65%～70%時，用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將純化后的pRNT-U6-siFAP和pRNT-U6-siMOCK分別轉染細胞。采用含有新霉素1000 μg/ml的培養基篩選陽性細胞克隆，并在含新霉素500 μg/ml的培養基中擴大培養。分別取穩定表達pRNT-U6-siFAP或pRNT-U6-siMOCK的mPCa-FCs-1212細胞作為實驗組，以不轉染質粒的mPCa-FCs-1212細胞作為對照組，調整細胞濃度至1×105個/ml。mPCa-1212為中山醫院普外科中心實驗室保存，常規培養、傳代。取對數生長期癌細胞，以1∶1的比例分別與上述3組mPCa-FCs-1212共培養3 d。

三、FAP mRNA表達檢測

收集3組mPCa-FCs-1212細胞，應用Trizol(Invitrogen公司)抽提細胞總RNA，應用ReverTra Ace-α First Strand cDNA Synthesis Kit[日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司]逆轉錄成cDNA。以cDNA為模板，應用SyBR Green RealTime PCR Master MIX[日本東洋紡(TOYOBO)生物科技(上海)有限公司]在熒光定量PCR儀上行實時定量PCR。FAP引物為5′-AGGTCTGCAGAGAAGCAAGAATAC-3′和5′-GAATACGAGTGTCAGACA-TGG-3′；內參GAPDH引物為5′-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3′和5′-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3′。退火溫度為58℃，擴增循環數為40次。采用2-△△Ct(△△Ct=△Ct轉染組-△Ct對照組)公式計算mRNA表達量。各樣本重復3次，取均值。

四、FAP蛋白表達檢測

收集3組mPCa-FCs-1212細胞，提取細胞蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測FAP蛋白表達。兔抗小鼠FAP抗體及內參β-actin抗體(Santa Cruz公司)1∶1000稀釋， AP標記的二抗(Jackson Immuno-research公司)1∶1000稀釋，最后ECL發光。利用BandScan軟件分析各條帶的灰度值，以(FAP 條帶灰度值-背景灰度值)/(β-actin灰度值-背景灰度值)的百分值表示。

五、細胞增殖抑制檢測

取3組共培養細胞，以每孔1×104個密度接種于96孔培養板各孔，分別培養1～7 d，每組每天設3個復孔。檢測時每孔加入MTT 20 μl(5 mg/L)培養4 h，離心去上清，加入DMSO溶解沉淀，用酶標儀測各孔490 nm處的吸光值(A490)，取均值。細胞增殖抑制率=(1-實驗組A490值/對照組A490值)×100%。

六、細胞凋亡檢測

取3組共培養3 d的細胞，PBS洗滌2次后重懸細胞，調整細胞濃度為1×104個/ml，加入Annexin V-APC結合液室溫避光孵育10 min，加入碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。以20 000個細胞為檢測單位，實驗重復3次。

七、統計學處理

結 果

一、siFAP轉染的沉默效果

siFAP組、siMOCK組、對照組mPCa-FCs-1212細胞的FAP mRNA相對表達量分別為0.584±0.029、1.052±0.281、1.103±0.325， siFAP組顯著低于siMOCK組及對照組(P=0.0213、0.0187)，而siMOCK組與對照組的差異無統計學意義 (P=0.0732)。

siFAP組、siMOCK組、對照組mPCa-FCs-1212細胞的FAP蛋白相對表達量分別為(27.18±3.23)%、(61.58±4.72)%、(65.29±4.78)%(圖1)。siFAP組顯著低于siMOCK組和對照組 (P=0.0317、0.0389)，而siMOCK組與對照組的差異無統計學意義(P=0.0912)。

圖1siFAP組(1)、siMOCK組(2)、對照組(3)細胞的FAP蛋白表達

在免疫熒光顯微鏡下觀察， siFAP組的成纖維細胞的胞質中呈現很弱的紅色熒光，而siMOCK組和對照組的成纖維細胞的胞質呈現出明顯的紅色熒光(圖2)，與蛋白質印跡法檢出的蛋白表達結果相吻合。

圖2siFAP組(a)、siMOCK組(b)、對照組(c)細胞的FAP蛋白表達(熒光顯微鏡 ×200)

二、mPCs-1212細胞增殖抑制率

與siFAP轉染的mPCa-FCs-1212細胞共培養的mPCa-1212細胞增殖抑制率隨時間的延長而增加，而與siMOCK轉染或未轉染的mPCa-FCs-1212細胞共培養的mPCa-1212細胞在培養第2天即進入指數生長期，至第5天開始增殖略變慢(圖3)。siFAP轉染的mPCa-FCs-1212細胞對mPCa-1212細胞的增殖抑制率顯著高于siMOCK轉染或未轉染的mPCa-FCs-1212細胞(P值均<0.01，表1)。

圖3 各組細胞的增殖抑制率

組別第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天siFAP組2．51±2．7010．01±3．4023．02±3．3232．73±2．4741．23±2．3847．34±1．2747．66±1．61siMOCK組1．01±0．201．21±0．671．11±0．232．05±0．874．73±1．896．79±2．127．11±1．56未轉染組0．90±0．301．03±0．811．07±0．431．89±0．763．78±1．795．82±2．116．92±1．89P值-0．00920．00740．99220．00780．00060．0004

注：P值為siFAP組與未轉染組比較；-：未行統計學分析

三、mPCa-1212細胞凋亡的變化

siFAP、siMOCK轉染及未轉染的mPCa-FCs-1212細胞分別與mPCa-1212細胞共培養3 d后，mPCa-1212細胞的凋亡率分別為(42.31±5.34)%、(7.38±2.09)%及(7.02±2.09)%。凋亡細胞主要以早期凋亡為主，偶爾也伴隨少數的晚期凋亡和壞死細胞。與siFAP轉染的mPCa-FCs-1212細胞共培養的mPCa-1212細胞的凋亡率顯著高于與siMOCK轉染或未轉染mPCa-FCs-1212細胞共培養的mPCa-1212細胞(P值均為0.000)。

討 論

腫瘤相關成纖維細胞(TAFs)能夠促進腫瘤細胞的侵襲、生長和轉移。FAP則是TAFs表面的一個增殖性標志物，其過度表達可以促進局部上皮細胞增殖及腫瘤細胞的增殖和轉移[4]。研究發現，惡性腫瘤基質成分的50%～95%是由FAP表達陽性的成纖維細胞所構成，其主要位于血管周圍，可與血液循環中的抗體結合。此外FAP是一種僅在局部表達的膜分子，不能分解為可溶性產物進入血液循環，從而保證腫瘤局部有豐富的靶物質[5]。我們以往的實驗證實，在注射重組FAP核酸疫苗后，小鼠對胰腺癌的免疫耐受力明顯高于未免疫小鼠，其對于小鼠胰腺癌的增殖有一定的抑制效果[6]。

本研究結果顯示，轉染了siFAP的mPCa-FCs-1212細胞的FAPmRNA及蛋白表達被明顯抑制，證實本研究所設計的siRNA序列是正確的，同時也表明，mPCa-FCs-1212細胞過表達FAP基因。

mPCa-FCs-1212細胞的FAP基因被沉默后，可以抑制小鼠胰腺癌細胞的生長，促進并導致該細胞發生凋亡。

由此可見，FAP蛋白的表達與小鼠胰腺癌細胞及腫瘤相關成纖維細胞的增殖和凋亡關系密切。當FAP蛋白呈現穩定的高表達時，無論是胰腺癌上皮細胞還是腫瘤相關成纖維細胞都呈現出良好的生長狀態，且細胞增殖明顯；而當FAP表達受抑制時，上述細胞的增殖和生長狀態均受到抑制并開始出現凋亡，且隨培養時間的延長日趨明顯。本研究結果可為針對TAFs作為治療目標，開展靶向性生物治療研究提供實驗基礎和理論依據。

參考文獻

[1] Aggarwal S, Brennen WN, Denmeade SR, et al. Fibroblast activation protein peptide substrates identified from human collagen I derived gelatin cleavage sites. Biochemistry, 2008, 47:1076-1086.

[2] 邵葉波,許雪峰,靳大勇,等.小鼠成纖維活化蛋白真核表達載體的構建及表達.中華實驗外科雜志,2010,27:452-454.

[3] Bracken AP, Pasini D, Helin K, et al. EZH2 is downstream of the pRB-E2F pathway, essential for proliferation and amplified in cancer. EMBO J, 2003，22:5323-5335.

[4] Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer,2006, 6:392-401.

[5] Minchinton AI, Tannock IF. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer, 2006, 6:583-592.

[6] 邵葉波,許雪峰,靳大勇,等. 小鼠成纖維細胞活化蛋白核酸疫苗對其宿主胰腺癌抑制作用的研究.中華普通外科雜志,2012,27:61-62.

Effectoffibroblastactivationproteinexpressionsilencingofmousefibroblastcellsontheproliferationofmousepancreaticcancercells

SHAOYe-bo,JINDa-yong,RONGYe-fei,XUXue-feng.

DepartmentofGeneralSurgical,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

Correspndingauthor:XUXue-feng,Email:xu.xuefeng@zs-hospital.sh.cn

ObjectiveSmall interfering RNA (siRNA) was used to silence the fibroblast activation protein (FAP) expression of mouse pancreatic cancer related fibroblast cells (mPCa-FCs-1212), and to observe the effects of mPCa-FCs-1212 silencing FAP gene on mouse pancreatic cancer cells (mPCa-1212) proliferation and apoptosis.MethodsThe small interfering RNA targeting FAP gene was designed; the recombinant siRNA plasmid siFAP and control plasmid siMOCK was constructed, which were transfected into mPCa-FCs-1212, respectively. The FAP mRNA and protein expression in transfected cells were examined by real-time PCR and Western blotting. The mPCa-1212 and transfected mPCa-FCs-1212 were co-cultured with a 1∶1 ratio in vitro. The growth inhibitory rates and apoptosis rates of mPCa-1212 were detected by MTT assay and Annexin V-FITC/PI staining and FCM assay.ResultsThe mRNA and protein expressions of FAP in siFAP transfected mPCa-FCs-1212 were significantly down-regulated when compared with that in siMOCK transfected mPCa-FCs-1212[0.584±0.029vs.1.052±0.281,P=0.0213; (27.18±3.23)%vs. (61.58±4.72)%，P=0.0317]. The mPCa-1212 was co-cultured with the mPCa-FCs-1212 transfected with siFAP or siMOCK for 3 d, and the inhibitory rates of mPCa-1212 were (23.02±3.32)% and (1.11±0.23)%, and the apoptosis rates were (42.31±5.34)% and (7.38±2.09)%， the difference between the two groups was statistically significant (P=0.000).ConclusionsmPCa-FCs-1212 silencing FAP gene can inhibit the proliferation of mPCa-1212 in vitro and induce cell apoptosis, and may be a potential new approach to gene therapy.

RNA, small interfering; Gene silence; Fibroblast activation protein; Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.008

復旦大學附屬中山醫院青年基金資助項目(科補-261)

200032 上海，復旦大學普外科研究所 復旦大學附屬中山醫院普外科

許雪峰，Email: xu.xuefeng@zs-hospital.sh.cn

2012-03-07)

(本文編輯：呂芳萍)