T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1在胰腺癌中的表達及其意義

郭興軍 田銳 王敏 何政 李旭 謝晨成 趙睿 秦仁義

T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1在胰腺癌中的表達及其意義

郭興軍 田銳 王敏 何政 李旭 謝晨成 趙睿 秦仁義

T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor,Tiam1)被證實在多種腫瘤細胞系中表達，且在腫瘤的發生發展中起到重要作用[1-4]，但Tiam1與胰腺癌的關系尚不明確。本研究檢測Tiam1在胰腺癌組織及胰腺癌細胞株中的表達，探討其臨床意義。

一、材料和方法

1．材料：收集我院2009年1月至2010年12月手術切除的胰腺癌組織標本27例，術后病理診斷為胰腺導管腺癌。人胰腺癌細胞系PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、ASPC1、PC3為本實驗室長期冷凍保存，復蘇后常規培養、傳代。

RPMI 1640培養基購自HyCone公司；新生牛血清購自HyClone公司；Trizol試劑購自invitrogen公司；Reverse Transcription System試劑盒、Tiam1和GAPDH濃縮型兔抗人Tiam1多抗購自abcam公司。SABC、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。蛋白質印跡法相關試劑購自武漢博士德公司。ECL顯色試劑盒、全細胞蛋白提取試劑盒、BCA法測蛋白濃度試劑盒均購自碧云天公司。

2．Tiam1 mRNA表達檢測：應用Trizol提取胰腺癌細胞總RNA。應用逆轉錄試劑盒(TOYOBO公司)行逆轉錄反應。應用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)行實時PCR擴增。應用Primer 5.0軟件設計引物,Tiam1的上游5′-AGACGTACTCAGGCCATGTC-3′，下游5′-ACC-CAAATGTCGCAGTCAGG-3′，產物252 bp；內參GAPDH上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCC-GTTCTCAG-3′，產物259 bp。引物由Invitrogen公司合成。PCR反應條件：95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，40個循環。mRNA表達量用2-ΔΔCt公式計算。ΔΔCt =[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]實驗組-[Ct(Tiam1)-Ct(GAPDH)]對照組。 以MIAPaCa2的表達量作為對照，計為1。重復3次實驗,取均值。

3．Tiam1蛋白檢測：用細胞裂解液提取全細胞蛋白，BCA法測蛋白濃度。常規行蛋白質印跡法檢測Tiam1蛋白表達。Tiam1抗體工作濃度為1∶100。用Quality one軟件對條帶進行定量吸光值分析，以MIAPaCa2的表達量作為對照，計為1。

胰腺癌和癌旁正常胰腺組織采用免疫組化染色法檢測Tiam1蛋白表達。Tiam1抗體工作濃度為1∶500,以PBS取代一抗為陰性對照。胞質和胞膜出現棕黃色顆粒為陽性。高倍鏡下觀察5個視野。判斷標準[5]：無染色為陰性，淺黃色細胞≤10%為可疑陽性(±)，淺黃色細胞>10%為弱陽性(+)，棕黃色細胞>30%為陽性(++)，棕黃色細胞>70%為強陽性(+++)。±、+為低表達，++、+++為高表達。

4．統計學處理：采用SPSS17.0軟件包進行處理。免疫組化結果采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

二、結果

MIA-PaCa2、PANC1、BxPC3、ASPC1、PC3細胞的Tiam1 mRNA表達水平分別為1、0.9883、0.6391、0.5340、0.4067； Tiam1蛋白表達水平分別為1、0.9711、0.5743、0.3720、0.2902(圖1)。

27例胰腺癌標本中均有Tiam1蛋白表達，而癌旁正常胰腺組織中不表達Tiam1蛋白(圖2)。胰腺癌組織Tiam1蛋白表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無關，而與胰腺癌的病理分化程度和轉移明顯相關(表1)。

圖1 胰腺癌細胞Tiam1蛋白的表達

圖2胰腺癌旁組織(a)、胰腺癌組織Tiam1蛋白低(b)和高(c)表達(×100)

表1 胰腺癌組織Tiam1蛋白表達與臨床病理特征間的關系

討論Tiam1基因位于人染色體21q22·1，其編碼產物是由1591個氨基酸殘基組成的蛋白質，屬于Dbl家族成員(diffuse B-cell lymphoma oncogene family)[6]。Tiam1含有許多重要的功能區：羧基端DH和PHc功能區，氨基端PHn-CC-EX結構區和DHR(或稱PDZ)、RBD功能區等。

Borguignon等[7]報道，Tiam1可以通過影響下游的rac1調節細胞的增殖、侵襲轉移。王雅娟等[8]報道，Tiam1在結腸癌、乳腺癌的發生發展中起到重要作用。Engers等[4]、Ding等[9]報道，Tiam1表達與肝癌、前列腺癌患者的預后密切相關， Tiam1高表達患者的預后明顯較差。本研究結果顯示，胰腺癌細胞系的Tiam1蛋白和mRNA表達在侵襲能力較弱、分化程度較高的BxPC3、ASPC1、PC3細胞系中相對低表達；在侵襲能力較強、分化程度較低的MIAPaCa2、PANC1細胞系中相對高表達。胰腺癌組織100%表達Tiam1蛋白，而癌旁胰腺組織不表達Tiam1蛋白。提示Tiam1基因高表達參與胰腺癌的發生發展，其高表達反映了腫瘤的惡性生物學行為。

[1] Michel MM, Sarr MG, Oishi AJ, et al. Pancreatic cancer. CA Cancer J Clin, 1994,44: 304-318.

[2] Adams HC 3rd, Chen R,Liu Z,et al. Regulation of breast cancer cell motility by T-cell lymphoma invasion and metastasis inducing protein. Breast Cancer Res,2010,12: R69.

[3] 劉莉,許岸高,王蔚,等.大腸腫瘤中Tiam1的表達及臨床意義.臨床與實驗病理學雜志,2006,1001-7399(2006) 02-0137-04.

[4] Engers R, Mueller M, Walter A, et al. Prognostic relevance of Tiam1 protein expression in prostate carcinomas. Br J Cancer, 2006,95:1081-1086.

[5] Uozaki H, Horiuchi H, Ishida T, et al. Overexpression of resistance-related proteins in osteosarcoma. Relationship with poor pregnosis Cancer,1997, 79: 2336-2344.

[6] Rossman KL, Der CJ, Sondek J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 167-180.

[7] Bourguignon LY, Zhu H, Shao L, et al. CD44 Interaction with Tiam1 promotes rac1 signaling and hyaluronic acid-mediated breast tumor cell migration. J Biol Chem,2000, 275:1829-1838.

[8] 王雅娟,胡潔,韓慧霞，等.Tiam1與大腸癌細胞EMT的關系.世界華人消化雜志,2009,17：3337-3341.

[9] Ding Y, Chen B,Wang S, et al. Overexpression of Tiam1 in hepatocellular carcinomas predicts poor prognosis of HCC patients. Int J Cancer,2009,124:653-658.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.015

國家自然科學基金(81001068)、(81071775)

430030 湖北武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院膽胰外科中心

秦仁義，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

2011-06-22)

(本文編輯：呂芳萍)