MAT1基因沉默對胰腺癌細胞生長的影響

劉建平 陶永勝 李輝 張世能 袁世珍

·短篇論著·

MAT1基因沉默對胰腺癌細胞生長的影響

劉建平 陶永勝 李輝 張世能 袁世珍

我們既往的研究證實，作為調控細胞周期循環的關鍵基因之一，人類MAT1(ménage à trios 1)基因在胰腺癌組織中表達增強，它參與胰腺癌的發生[1-2]。轉染反義MAT1基因可使胰腺癌細胞出現明顯的G1期阻滯[3]。為此，本研究應用體外轉錄法合成靶向MAT1基因的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，轉染胰腺癌Capan-2細胞，觀察其對細胞的生長抑制效應，探討siRNA沉默MAT1基因用于胰腺癌基因治療的可行性。

一、材料與方法

1．細胞培養及MAT1蛋白表達的檢測：人胰腺癌細胞株Capan-2從美國加州大學引進，常規培養、傳代。收集對數生長期細胞，裂解提取蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測細胞MAT1蛋白表達。羊抗人MAT1多抗(Santa Cruz biotechnology公司)工作濃度1∶100，兔抗羊IgG單抗(Santa Cruz biotechnology公司)工作濃度1∶500，用PBS代替抗體作為陰性對照。細胞胞質或胞核出現棕黃色顆粒為陽性[2]。

2．靶向MAT1的siRNA合成及細胞轉染：參照Elbashir等[4]的哺乳動物細胞RNAi的“AA-N19”設計原則，以MAT1基因的cDNA序列為模板，篩選4條mRNA序列：序列1：5′-GGUGUUGUCCAAAUCCACAUU-3′；序列2：5′-GUCGUUCCACUUCUAAAGCUU-3′；序列3：5′-ACGUCACUGGUUUUACAGGUU-3′；序列4：5′-CUGUGGAAAACGUCA CUGGUU-3′。另設計1條陰性對照序列，5′-AGCGGAUCCAAUCUUUGUGUU-3′。 在GenBank數據庫中使用BLAST以確保目的序列與其他基因沒有同源性。然后根據堿基互補原則設計出總長度為29個堿基的脫氧核苷酸鏈，共10條，由QIAGEN-Operon公司合成。采用SilencerTMsiRNA Construction Kit(Ambion公司)在體外轉錄合成4條21-nt的靶向MAT1的siRNAs(siRNA-MAT1)和陰性對照的siRNAs(siRNA-C)。用紫外分光光度儀檢測每一條siRNA的產量和純度，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物大小和完整性。用SilencerTMsiRNA Labeling Kit(cy3)(Ambion公司)標記siRNAs，用SilencerTMsiRNA Transfection Kit(Ambion公司)將5條siRNAs分別轉染Capan-2細胞，在熒光顯微鏡下直接計數判斷轉染效率[2]。應用4條siRNA-MAT1中轉染效率最高的細胞進行以下實驗。

3．細胞生長曲線繪制：取對數生長期siRNA-MAT1轉染細胞、siRNA-C轉染細胞、未轉染細胞，分別以1×105個細胞密度接種于6孔細胞培養板的各孔，其中未轉染細胞又分為Lipid對照組(培養液中加Lipid)和空白對照組。連續培養3 d，并于每天同一時間消化細胞，光鏡下直接計數活細胞數量，按我們以往的方法[2]繪制各組細胞的生長曲線圖。

4．細胞周期及增殖指數檢測： 分別取siRNA-MAT1轉染組和空白對照組細胞，連續培養3 d，按我們以往的方法[2]上流式細胞儀分析細胞周期曲線，并計算細胞增殖指數(PI)。

5．統計學處理：應用SPSS11.5統計軟件分析，計量資料用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

二、結果

1．Capan-2細胞的MAT1蛋白表達：MAT1蛋白在胰腺癌細胞株Capan-2中呈強陽性表達(圖1)。

圖1siRNA-MAT1轉染(a)和未轉染細胞(b)MAT1表達(×200)

2．siRNA-MAT1的轉染效率：Capan-2細胞中轉染效率>90%，轉染后Cy3熒光能持續96 h(圖2)。

圖2Capan-2細胞轉染siRNA-MAT1后的光鏡(a)及熒光顯微鏡下(b)照片(×400)

3．siRNA-MAT1轉染對Capan-2細胞增殖的影響：4條設計合成的siRNAs序列中有2條(序列2和序列3)可顯著抑制Capan-2細胞的生長，其中序列2在72 h后細胞生長抑制率為21.6%，96 h后的生長抑制率為26.7%；序列3在72 h后細胞生長抑制率達38.8%，96 h后的抑制率達41.8%(圖3)，二者有差異(P<0.01)，故選取序列3繼續后續實驗。流式細胞儀分析顯示siRNA-MAT1(序列3)轉染組轉染48 h后G0/G1期細胞比例明顯上升，到72 h后已出現明顯的G0/G1期細胞滯留，S期細胞比例明顯下降，PI值亦明顯下降，有顯著性差異(表1)。

圖2 siRNA-MAT1(序列3)抑制BxPC3細胞增殖生長

組別轉染后24hG0/G1SPI空白對照組52．9±1．922．8±1．946．8±2．5轉染組53．5±1．926．1±1．8a47．1±1．8組別轉染后48hG0/G1SPI空白對照組54．5±1．130．6±1．245．5±1．2轉染組70．3±1．6b20．0±0．9a29．6±1．6b組別轉染后72hG0/G1SPI空白對照組57．9±1．624．3±1．942．1±1．7轉染組81．9±2．3b11．3±0．7b18．1±0．7b

注：與空白對照組比較，aP<0.05；bP<0.001

討論既往研究早已明確細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK )在細胞生長周期中所起的作用，而作為CDK的激活激酶(CDK activating kinase,CAK)是通過影響CDK的活性來控制細胞進程的。MAT1基因是CAK這一三聚體復合物( MAT1/CDK7/Cyclin H)的重要組成部分，對CAK的活性起著分子開關的作用。 Rossi等[7]經典的基因敲除實驗已證實，MAT1 (-/-)基因缺陷型小鼠細胞不能進入S期，從而影響細胞的增殖和生長。Wu等[8]報道，轉導反義MAT1的RNA進入骨肉瘤細胞株MG-63，72 h后細胞生長抑制率約33.3%，G0/G1期細胞比例由44.2%上升到67.0%。Zhang等[9]轉導反義MAT1的RNA進入成神經細胞瘤CHP126細胞中， 72 h后G0/G1期細胞比例由43%上升到66%。張世能等[3]證實，轉染反義MAT1的RNA進入胰腺癌BxPC3細胞后,通過CAK磷酸化Rb途徑影響細胞周期蛋白，使細胞生長阻滯于G1期的晚期。Ohkawa等[10]發現，丙肝病毒核心能使MAT1從CAK中分離，從而削弱了細胞由G1期向S期轉化的能力。基于MAT1基因在調節信號分子轉導、控制細胞周期進程、影響細胞增殖或凋亡等方面的關鍵性作用，可以推測，在未來的抗病毒治療(如艾滋病，病毒性肝炎)和腫瘤基因治療的靶目標中，MAT1基因是值得期待的一個突破口[11-13]。

我們以往的實驗結果顯示，轉染siRNA-MAT1 72 h后，胰腺癌BxPC3細胞生長明顯受抑制[2]。本實驗在Capan-2細胞中又獲得相似結果，高比例的細胞滯留于G0/G1，未見明顯凋亡峰出現，再一次證實MAT1基因的正常表達是細胞從G1期進入S期所必需的，單純下調MAT1蛋白的表達即可抑制腫瘤細胞生長，使其滯留于G0/G1期。我們以往的實驗顯示，反義MAT1的RNA在非腫瘤細胞中可誘發明顯的細胞凋亡，但在腫瘤細胞中均未見凋亡峰出現[2-3,8-9]。本實驗在Capan-2細胞中亦未誘發細胞凋亡，提示靶向MAT1基因的單純反義RNA或RNAi干擾沉默技術可能都不足以使腫瘤細胞出現明顯的凋亡。

[1] 劉建平,袁世珍,張世能,等.胰腺癌中MAT1蛋白的表達與其臨床病理特征的關系.中國病理生理雜志，2005，21：163-166.

[2] 劉建平, 袁世珍, 張世能. 小干擾RNA沉默MAT1基因治療胰腺癌的實驗研究. 中華醫學雜志，2007，87：2719-2723.

[3] 張世能,徐鳳琴,黃志清,等.反義MAT1重組腺病毒對人胰腺癌細胞BxPC-3的周期調控作用.中華醫學雜志，2005，85：1348-1351.

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[9] Zhang S, He Q, Peng H, et al. MAT1-modulated cyclin-dependent kinase-activating kinase activity cross-regulates neuroblastoma cell G1 arrest and neurite outgrowth. Cancer Res, 2004, 64: 2977-2983.

[10] Ohkawa K, Ishida H, Nakanishi F, et al. Hepatitis C virus core functions as a suppressor of cyclin-dependent kinase-activating kinase and impairs cell cycle progression. J Biol Chem, 2004, 279:11917-11926.

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.016

518029 深圳，廣東省邊防總隊醫院消化內科(劉建平、陶永勝、李輝)；中山大學附屬第二醫院消化內科(張世能、袁世珍)

劉建平，Email: championliu@yahoo.com.cn

2011-06-24)

(本文編輯：屠振興)