水通道蛋白5在急性壞死性胰腺炎大鼠肺毛細血管滲漏中的作用

陳紀猛 黃鶴光

水通道蛋白5在急性壞死性胰腺炎大鼠肺毛細血管滲漏中的作用

陳紀猛 黃鶴光

重癥急性胰腺炎(SAP)疾病兇險，早期易發生多器官衰竭[1]，以呼吸道衰竭最多見，預后很差[2-3]。本研究檢測水通道蛋白5(aquaporin 5, AQP5)在急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織中的表達，觀察肺毛細血管滲漏性肺水腫的嚴重程度，探討AQP5在肺毛細血管滲漏過程中的作用及意義。

一、材料和方法

1．實驗動物與分組：健康清潔級成年SD大鼠80只，體重200～230 g，實驗前在福建醫科大學實驗動物中心適應性飼養1周。按完全隨機法隨機分成ANP組和對照組，各40只。參考楊波等[4]制模方法，用微量泵以0.04 ml/min速度穩定勻速地向膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重，待胰腺組織出現肉眼可見的出血水腫后拔出導管，絲線縫扎，逐層關腹。對照組僅翻動胰腺后關腹。蘇醒后禁食水，通過背部皮下注射生理鹽水40 ml/kg體重，1次/8 h。術后3、6、12、24 h各處死10只大鼠，計胸腔積液量。

2．血清淀粉酶活性檢測及胰腺組織學檢查：下腔靜脈抽血，分離取血清，上全自動生化分析儀(LX20，Beckman, USA)檢測血清淀粉酶。取完整胰腺，常規病理檢查，由兩位病理專業醫師采用雙盲法讀片并參考Schmidt等[5]標準評分。

3．肺濕干重比及組織學檢查：開胸取右肺稱濕重，然后置70℃烤箱中烤2 d至恒重，稱其干重，計算肺濕干重比(W/D)。取部分左上肺常規病理檢查，由兩位病理專業醫師采用雙盲法讀片并參考Thomet等[6]標準評分。

4．肺組織AQP5蛋白表達檢測：取部分左下肺組織固定于4%多聚甲醛+0.3%戊二醛固定液中8～24 h，常規行免疫熒光組織化學法檢測AQP5蛋白表達。兔抗大鼠AQP5(1∶500)IgG購自Santa cruz biotechnology公司，羊抗兔IgG-TRITC(1∶200)購自Abcam公司。取部分左肺新鮮組織，將組織塊在冰上研磨成勻漿，加入細胞裂解液冰上孵育，取上清常規行蛋白質印跡法檢測AQP5蛋白表達。所用抗體同上，最后ECL發光，X線曝光、顯影、掃描，獲取內參條帶灰度比值表示蛋白表達量，以對照組為1，計算表達倍數。

5．AQP5 mRNA表達檢測：應用熒光定量PCR法檢測。取部分左肺組織，液氮研磨后加入RNAisoTMPlus (TaKaRa公司)，經氯仿、異丙醇、75%乙醇洗脫，提取RNA。采用實時定量PCR法檢測AQP5 mRNA表達。AQP5引物：5′-CCCTACCCAGAAGACCCAGT-3′，5′-CCATCTTGTGGGGATCTA-CTTCAC-3′，擴增片段112 bp；內參GAPDH引物：5′-TCTTCC-AGGAGCGAGATCCC-3′，5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，擴增片段320 bp。反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40個循環。應用公式2-△△Ct計算mRNA表達量，以對照組為1。

二、結果

1．血清淀粉酶水平變化及胰腺病理改變：對照組大鼠血清淀粉酶活性無明顯變化，胰腺組織未見病理改變。ANP組大鼠血清淀粉酶活性較對照組顯著增加，12 h時達峰值；胰腺不同程度水腫、出血、炎癥細胞浸潤，腺葉間隙增寬，腺泡破裂，胰腺細胞壞死，隨時間延長而加重，病理評分逐漸增加(圖1，表1)。

2．胸腔積液發生率：ANP組大鼠12 h點有1只大鼠(10%)出現胸腔積液，約3 ml，24 h點有3只大鼠(30%)出現胸腔積液，液量為3～7 ml。對照組大鼠均未見胸腔積液。

3．肺濕干重比及肺組織學改變：對照組大鼠肺濕干重比無明顯變化，肺組織未見病理改變。ANP組大鼠的肺濕干重比于3 h后開始且逐漸增加，肺組織早期只出現肺間質水腫、炎癥細胞浸潤；后期肺間質和肺泡出現出血、水腫、滲出，大量肺泡萎陷，剩余少量肺泡代償性擴張，大量炎細胞浸潤，病理評分逐漸增加(圖2，表1)。

圖1對照組(a)及ANP 3、6、12、24 h組(b～e)大鼠胰腺病理改變(HE ×100)

圖2對照組(a)及ANP 3、6、12、24 h組(b～e)大鼠肺組織病理改變(HE ×100)

組別血清淀粉酶(U/L)肺濕干重比肺組織病理評分胰腺病理評分ANP組 3h1528±2904．92±0．183．65±0．934．73±0．47 6h3831±5655．22±0．1712．65±1．988．38±0．72 12h6651±11585．83±0．2822．70±1．7813．75±0．66 24h2471±4006．50±0．2329．25±1．0715．95±0．15對照組 3h834±974．46±0．1600．08±0．18 6h794±884．59±0．1700．03±0．11 12h831±934．57±0．2400．15±0．29 24h796±934．61±0．1000．13±0．29P值<0．001<0．001-<0．001

4．肺組織AQP5蛋白及mRNA表達的變化：對照組大鼠肺組織熒光標記的AQP5的熒光強度無明顯變化，ANP組大鼠肺組織熒光標記的AQP5的熒光強度在3 h時無明顯變化，在6 h后逐漸降低 (圖3)。ANP組大鼠肺組織AQP5蛋白表達量在3 h時為1.02±0.13，與對照組比較差異無統計學意義(P=0.660)，在6、12、24 h時為0.90±0.08、0.69±0.07、0.49±0.08，均較3 h時顯著減少(P值均<0.05,圖4)；AQP5 mRNA表達量在3 h時為1.06±0.12，與對照組差異無統計學意義(P=0.147)，在6、12、24 h時為0.75±0.15、0.51±0.12、0.30±0.07，均較3 h時顯著減少(P值均<0.05)。

圖3對照組(a)及ANP 3、6、12、24 h組(b～e)大鼠肺組織AQP5表達(免疫熒光組化 ×500)

圖4對照組3、6、12、24 h(1、3、5、7)和ANP 3、6、12、24 h組(2、4、6、8)大鼠肺組織AQP5表達(蛋白質印跡法)

討論AQPs與肺組織液體轉運密切相關，在肺泡、肺間質和肺毛細血管間的水跨膜轉運中發揮主要作用，調節肺水平衡[7-8]。Ⅰ型肺泡上皮細胞主要表達AQP5，亦表達AQP4。Ⅱ型細胞主要表達AQP1，亦表達AQP3[9]。由于Ⅰ型肺泡細胞占據肺泡膜表面積的90%，因此肺泡上皮細胞介導肺泡內外水跨膜轉運以AQP5為主導。Verkman等[10]報道，AQP5基因敲除小鼠的肺泡和毛細血管間的水通透性降低10倍。Towne等[11]報道，急性損傷的肺組織中AQP5 mRNA 和蛋白表達水平下調。AQP5表達下調與肺水腫形成相關。本研究結果顯示，ANP大鼠并發的肺損傷組織AQP5 mRNA及蛋白的表達下降，肺水腫程度加重，這是因為AQP5表達下調降低了AQP5介導的水分子跨膜轉運效率，導致肺毛細血管滲漏至肺泡內的水腫液回吸收減少所致，與上述研究結果一致。但有研究證實，在肺損傷模型中AQP5 mRNA 和蛋白的表達量增加[12]，在氧毒性肺損傷小鼠肺組織中AQP5表達在不同時間點可上調或下調[13]，這可能與不同肺損傷的模型有關，然而確切的原因尚需進一步探討。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.020

國家自然科學基金(81070369)

350001 福州，福建醫科大學附屬協和醫院顯微外科實驗室

黃鶴光，Email: hhuang2@yahoo.com.cn

2011-07-20)

(本文編輯：呂芳萍)