豬胰頭部冷凍的炎癥反應觀察

曾健瀅 李家亮 陳繼冰 周亮 方剛 鄧春娟 姚飛 黃生權 劉衛群 邱大衛 牛立志 左建生 徐克成

豬胰頭部冷凍的炎癥反應觀察

曾健瀅 李家亮 陳繼冰 周亮 方剛 鄧春娟 姚飛 黃生權 劉衛群 邱大衛 牛立志 左建生 徐克成

氬氦刀冷凍技術是近年興起的微創腫瘤療法之一，可作為手術切除的輔助療法，有效消融不能手術切除的肝癌[1-2]、肺癌[3]和前列腺癌[4]等惡性腫瘤。目前該技術開始運用于治療不能手術切除的胰腺腫瘤[5]，并多見于治療胰體尾部腫瘤。由于胰腺體積小，橫徑薄及質地軟，且胰頭部緊貼周圍肝、胃和十二指腸、門靜脈等重要器官和血管，故對于胰頭部的冷凍難以完全照搬其他器官冷凍時的成功經驗，使得冷凍治療胰頭癌仍處于起步階段，其安全和有效性仍有待于實驗和臨床的進一步觀察。本研究使用西藏小型豬，觀察其胰頭部冷凍后產生的局部及全身性炎癥反應，為臨床研究提供實驗基礎。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：普通級西藏小型豬10頭，雄性，體重25～35 kg，由南方醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(粵)2006-0015，動物合格證號粵監證字0087238。按數字表法隨機分成冷凍組(4頭)、陰性對照組(3頭)和空白對照組(3頭)。血清IL-6、IL-8、TNF-α、淀粉酶和C-反應蛋白(CRP)的ELISA試劑盒均購自上海朗頓生物技術有限公司，檢測用酶標分析儀(美國Rayto公司，RT-6500)；血常規檢測設備為全自動血液分析儀(日本Sysmex公司，KX-21)。

2．胰頭部冷凍方法：氬氦冷凍系統，包括主機、2 mm冷凍探針和探溫針均為美國Endocare公司產品(CryocareTM)。小型豬術前禁食24 h，禁水12 h。以3%的異氟烷混合氣體面罩誘導麻醉，并以1%～1.5%濃度維持術中麻醉。消毒、鋪單后開腹，分離胰腺。將直徑為2 mm的冷凍探針直視下插入十二指腸襻胰頭部區域。冷凍中心點距十二指腸及門靜脈各1 cm，插入深度1 cm。盡可能避開主胰管，然后以100%的氬氣輸出功率激活探針，維持5 min后停輸氬氣，改輸氦氣復溫至10～20℃，維持3 min，重復以上冷凍-復溫循環1次后拔針。觀察冷凍時胰腺表面組織的形態變化，用游標卡尺測量并記錄冰球最大直徑，于冷凍中心點置一縫線作為標記，關腹結束手術。陰性對照組予以插針，不冷凍，維持10 min后關腹。空白對照組僅開、關腹。術后自由飲食，護理期間不給予藥物。術后第7天統計各組生存率，隨后對實驗豬實行安樂死，剖腹取胰腺。

3．血清淀粉酶、IL-6、IL-8、TNF-α和CRP檢測：術后第1、3、5天采血，離心分離血清，用雙抗體夾心ELISA法檢測血清淀粉酶、IL-6、IL-8、TNF-α、CRP水平。

4．血常規檢測：術后第7天經鎖骨下緣中央靜脈叢采血，通過全自動血液分析儀檢測血常規各項指標。

5．胰腺病理學檢查：肉眼觀察胰頭部冷凍壞死區域形態。標本送廣州金域醫學檢驗中心行病理學檢查。

二、結果

1．術中所見及術后存活率：冷凍時胰腺表面形成以探針為中心的界限清楚的白色圓形冰球區域(圖1)，冰球周圍組織形態、顏色無異常。冷凍區域最大直徑平均為(19.8±3.3)mm。實驗豬術中生命體征平穩，術中無死亡。術后48 h內均恢復正常飲食。術后7 d存活率100%。陰性對照組及空白對照組無異常改變。

2．胰腺病理改變：術后7 d，冷凍組胰腺肉眼可見冷凍中

心區形成近圓形紅褐色病灶，呈骨髓樣，質地糜爛；病灶周邊組織顏色蒼白，觸摸質地柔軟，與外周組織分界較明顯。其他區域胰腺組織眼觀無異常(圖2)。

病理檢查見胰頭部以插針點為中心，平均半徑為(5.9±0.7)mm的球狀區域組織完全壞死，周圍形成炎性反應帶和肉芽腫，內見大量細胞碎片和中性粒細胞浸潤(圖3)。陰性及空白對照組胰腺未見異常。

圖1豬胰頭部冷凍時冰球形成圖2冷凍組術后7 d的胰腺

圖3冷凍組胰腺冷凍部位(a)、陰性對照組插針部位(b，HE ×100)及冷凍組胰腺完全壞死區(c)、炎性反應帶(d，HE ×400)

3．血清淀粉酶、IL-6、IL-8、TNF-α和CRP水平的變化：冷凍組各項血清指標在術后第1天均顯著升高，隨后均逐漸下降(表1)。冷凍組術后1、3、5 d血清TNF-α水平分別為(159.0±21.9)、(149.9±23.9)、(132.0±20.2)ng/L，顯著高于陰性對照組的(139.8±6.9)、(123.7±6.1)、(117.5±5.0)ng/L和空白對照組的(130.3±7.2)、(115.4±11.1)、(107.2±3.7)ng/L(P值均<0.01)。術后第3天CRP水平恢復正常，第5天IL-8水平恢復正常(表1)。陰性對照組和空白對照組血清各項指標均無明顯改變。

表1 各組冷凍前后血淀粉酶、CRP、IL-6、IL-8水平變化

注：與冷凍組比較，aP<0.05；bP<0.01

4．血常規變化：術后第7天，冷凍組的淋巴細胞總數、淋巴細胞百分數較陰性對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，而其他指標與陰性對照組比較，差異均無統計學意義(表2)。

表2 各組在冷凍后第7天血常規的比較

注：與冷凍組比較，aP<0.05；bP<0.01

討論冷凍治療[6]是一種原位消融技術，其原理和基本方法是將冷凍探針插入靶組織，或將致冷源直接作用于靶組織，使局部溫度迅速降低，直接破壞靶組織內細胞或血管，影響或斷絕腫瘤的營養與氧氣供應，達到破壞靶組織的目的。氬氦刀冷凍治療已經廣泛推廣到多種實體腫瘤的治療[7-9]。由于胰腺具有特殊解剖位置，胰頭被包繞在十二指腸襻區域，胰周有下腔靜脈，腸系膜上靜脈、門靜脈、腸系膜上動脈等重要血管，并有主胰管及膽管經過，加之胰腺是具有內外分泌功能的重要器官，因此，對胰頭部冷凍，除造成胰腺正常組織壞死或損傷外，也可能造成十二指腸、胰周重要的大血管、胰管及膽管的損傷，使胰酶外泄，釋放入血液及組織間隙，并引起嚴重的炎癥反應。因此，氬氦刀冷凍消融胰腺組織所引起的炎癥反應程度，以及是否會引起急性胰腺炎，成為氬氦刀冷凍系統能否用于治療胰腺頭部腫瘤的關鍵。

姚榛祥等[10]報道，給予急性胰腺炎大鼠及狗冷凍治療后，血清及胰腺組織內的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及磷脂酶均比冷凍治療前顯著下降。他們認為血清胰酶水平下降的原因可能是冷凍區域產生凝固壞死及周圍細胞內酶蛋白滅活使釋放入血液的活性酶蛋白減少所致。本研究結果顯示，血清淀粉酶水平在冷凍后24 h即顯著升高，以后逐漸下降，在冷凍后5 d仍處于高位，但沒有超過陰性對照組水平的3倍。

體內TNF-α、IL-6、IL-8和CRP等免疫炎性因子水平可以反映出機體的炎癥水平。本研究結果顯示，冷凍組小型豬血清TNF-α、IL-6、IL-8在術后1、3、5 d均顯著高于空白對照組，隨后逐漸下降，而CRP水平僅在術后第1天呈一過性升高，隨即恢復到正常值水平，病理檢查見冷凍壞死區周邊出現中性粒細胞浸潤，表明胰腺冷凍損傷后存在炎癥反應，這與胰酶釋放入血，激活單核-巨噬細胞有關[11]。但胰腺的炎癥程度低，沒有引發嚴重并發癥。因此，我們認為，在胰頭部位進行冷凍可造成胰腺冷凍中心區組織壞死，并在短期內引發局部和全身輕微的炎癥反應，但引發的炎癥反應并不嚴重，沒有導致急性胰腺炎發生。因此，氬氦刀冷凍胰頭部相對安全，或可成為胰頭部惡性腫瘤的一種治療選擇。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.021

廣東省衛生廳醫學科研基金課題(WSTJJ2009-0401440106196602154756)

510305 廣州，中國科學院廣州生物院附屬復大醫院 廣州復大腫瘤醫院中心實驗室

牛立志，Email:fudaclab@gmail.com

2011-09-22)

(本文編輯：屠振興)