抗病毒分散片質量標準研究

肖 飛，陳 樺，李其鳳，馮柏康

(廣州中醫藥大學科技產業園有限公司，廣東 廣州 510445)

抗病毒分散片由連翹、板藍根、石膏、知母、石菖蒲、廣藿香等中藥加輔料組成，具有清熱祛濕、涼血解毒之功效，主治風熱感冒、溫病發熱及上呼吸道感染、流行性感冒、腮腺炎等病毒感染性疾病[1]。本試驗在抗病毒分散片優選制備工藝基礎上，進行產品質量控制方法研究，建立了連翹、板藍根、知母、石菖蒲薄層色譜鑒別方法，并用高效液相色譜法測定連翹苷的含量。該方法結果準確、操作簡便，可作為抗病毒分散片的質量控制方法。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2996型高效液相色譜系統，包括2695溶劑處理系統、2996二極管陣列檢測器、Empower色譜處理系統，(美國Waters公司);BP221S型電子天平(d=0.1 mg)，M215S型電子天平(d=0.01 mg)，均為德國Sartorius公司產品。抗病毒分散片為廣州中醫藥大學科技產業園有限公司自制;連翹苷對照品(批號為11082200406)、菝葜皂苷元對照品(批號為0744-200005)、連翹對照藥材(批號為120908-200305)、板藍根對照藥材(批號為121177-200305)、知母對照藥材(批號為121070-200306)、石菖蒲對照藥材(批號為121098-200402)，均購自中國藥品生物制品檢定所;陰性樣品(自制);乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜(TLC)鑒別

連翹[2-3]:取本品適量，研細，稱取4 g，加水30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯充分振搖提取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺連翹的陰性對照品4 g，同法制成陰性對照品溶液;再取連翹對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，100℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1 A)。

板藍根[4-5]:取本品適量，研細，取3 g，加水50 mL，加熱回流30min，離心，取上清液置分液漏斗中，用乙醚提取2次，每次30mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯0.5 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺板藍根的陰性對照品3 g，同法制成陰性對照品溶液;再取板藍根對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1 B)。

知母[6]:取本品適量，研細，稱取6 g，加水50 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液用水飽和的正丁醇提取2次，每次40 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加乙醇10 mL，鹽酸1 mL，加熱回流1 h后濃縮至約5 mL，再加水10 mL，用石油醚(60～90℃)30 mL振搖提取，石油醚提取液用0.5%氫氧化鈉溶液20 mL洗滌，棄去堿液，再用水20 mL洗滌，棄去水液，石油醚液蒸干，殘渣加乙醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺知母的陰性對照品6 g，同法制成陰性對照品溶液;再取知母對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液;取菝葜皂苷元對照品，加無水乙醇制成每1 mL含3 mg的溶液作為對照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-丙酮(19∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以8%香草醛無水乙醇溶液和硫酸溶液(7→10)的混合溶液(0.5∶5)，100℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1 C)。

石菖蒲[6-7]:取本品20片，粉碎過40目篩，加水50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液用石油醚(30～60℃)提取2次，每次50 mL，提取液水浴蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液;另取缺石菖蒲的陰性對照品12 g，同法制成陰性對照品溶液;再取石菖蒲對照藥材1 g，加石油醚(30～60℃)50 mL，超聲60 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(12∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液無干擾(圖1 D)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定[8]

2.2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱:Merk-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈-水(20∶80);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:277 nm。在上述色譜條件下，連翹苷在24 min出峰，理論板數按連翹苷計算 n=9 523;供試品溶液色譜在對照品溶液色譜相應保留時間上出現一色譜峰，連翹苷峰與其他峰的分離度大于1.5。

2.2.2 溶液制備

稱取連翹苷對照品8.04 mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容至10 mL，作為對照品貯備液;精密吸取貯備液1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，作為對照品溶液。取本品10片，研細，取4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定質量，浸漬過夜，超聲處理25 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁1 g拌勻，加置中性氧化鋁柱(200-300目，1 g，內徑 1.5 cm)上，用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺連翹的陰性對照品4 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性考察:取連翹苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，照2.2.1項下色譜條件測定。結果表明其他成分對連翹苷含量測定無干擾。高效液相色譜圖見圖2。

線性關系考察:精密吸取對照品溶液 2，6，8，10，20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量 X(μg)為橫坐標、峰面積值 Y為縱坐標作標準曲線圖，連翹苷回歸方程為Y=553 564X-6 457.3，r=0.999 9(n=5)。結果表明，連翹苷進樣量在0.160 8～1.608 0μg范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

圖2 高效液相色譜圖

精密度試驗:精密吸取對照品溶液，重復進樣5次。結果連翹苷峰面積的 RSD為0.82%(n=5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為100321)，精密稱取6份，分別照含量測定法制備供試品溶液并測定。結果連翹苷的平均含量為0.037 2%，RSD為2.3%(n=6)，表明方法重復性較好。

穩定性試驗:精密量取同一供試品溶液，在室溫下，分別在0，2，4，6，8 h時測定連翹苷峰面積。結果的 RSD為 1.4%(n=5)，表明樣品中連翹苷在測定的8 h內穩定。

加樣回收試驗:取同一批樣品(批號為100321)，精密稱取6份，分別精密加入連翹苷對照品貯備液1 mL，將甲醇揮干，分別照含量測定法制備供試品溶液，測定含量。結果見表1。

表1 連翹苷加樣回收試驗結果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

精密稱取本品，照含量測定法測定，標準曲線法計算樣品中連翹苷含量。結果批號分別為100321，100403，100411的3批樣品中連翹苷含量分別為0.28，0.27，0.28 mg/片。根據2010年版《中國藥典(一部)》規定，連翹藥材以連翹苷(C27H34O11)計，不得少于0.15%;抗病毒分散片以轉移率60%計，每粒含連翹苷(C27H34O11)應不低于0.20 mg。故暫訂本品每片含連翹以連翹苷(C27H34O11)計，應不低于0.20 mg。

3 討論

本研究中抗病毒分散片的提取工藝與部頒標準中抗病毒栓以及新藥轉正標準中抗病毒口服液、抗病毒膠囊、抗病毒糖漿、抗病毒片等不完全相同，因此質量控制指標及方法不盡相同。此外，本試驗還按照2010年版《中國藥典(一部)》附錄片劑項下規定，進行了質量差異、溶出度、分散均勻性及微生物限度等檢測，均符合規定。

本試驗對抗病毒分散片中廣藿香的薄層色譜鑒別方法進行了研究，以廣藿香對照藥材、百秋李醇對照品作對照，效果均不理想，試驗方法還有待進一步研究，故暫不列入質量標準。

[1]肖 飛，于 偉.抗病毒分散片的制劑工藝研究[J].湖北中醫學院學報，2006，8(2):34-35.

[2]王小龍，邢海英，王琳靜.薄層色譜法鑒別抗病毒口服液的前處理改進[J].中國藥師，2003，6(12):833.

[3]張秀麗.連翹敗毒丸的薄層層析鑒別[J].中國當代醫藥，2010，17(3):111.

[4]徐云友，徐連江.抗病毒質量標準研究[J].人參研究，2004，16(2):44.

[5]陳明江，汪 勛.復方南板藍根片的薄層色譜鑒別[J].中國藥業，2009，18(2):32.

[6]黃曉玲，劉鄉鄉.抗病毒口服液的質量標準研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15(3):182.

[7]黎奕明，眭道順.石菖蒲的薄層鑒別及β-細辛醚的含量測定[J].中藥新藥與臨床藥理，2009，20(4):369-370.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:159.