雜草和水稻梨孢菌親緣關系研究

毛雪琴， 邱海萍， 張 震， 姜 華， 柴榮耀， 王教瑜， 王艷麗， 孫國昌， 杜新法

(浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021)

毛雪琴，邱海萍，張 震，等. 雜草和水稻梨孢菌親緣關系研究[J]. 雜草科學，2012，30(4)：26-29.

雜草和水稻梨孢菌親緣關系研究

毛雪琴， 邱海萍， 張 震， 姜 華， 柴榮耀， 王教瑜， 王艷麗， 孫國昌， 杜新法

(浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地/浙江省農業科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021)

利用12個引物的隨機擴增多態性DNA標記(RAPD)對來自18種寄主的49個梨孢菌株進行了親緣關系分析，從DNA電泳譜帶中可以直觀地看出，來自同一種或同一屬或親緣關系相近寄主上的梨孢菌帶型較相似，相反，親緣關系較遠的寄主上的梨孢菌帶型差異較大，茭白、碎米莎草和馬唐寄主上的梨孢菌的譜帶均非常特異，與牛筋草和狗尾草等其他15種寄主的梨孢菌有較大差異，牛筋草和狗尾草等15種寄主的梨孢菌存在比較多的共有譜帶。對引物S380擴增的RAPD譜帶進行聚類分析表明，18種寄主上的49個梨孢菌株可分為5個類群。種與種之間的DNA( RAPD譜帶)電泳譜帶差異非常明顯，而種內品種間的帶型差異比較小。

梨孢菌； 隨機擴增多態性DNA(RAPD)； 聚類分析

梨孢菌(Pyriculariasp.)是重要的植物病原菌，以往對梨孢菌分類的依據是分生孢子、附著胞和分生孢子梗的形態學差異。但梨孢菌的形態變異性較大，環境條件和營養條件的不同往往引起孢子大小的差異。傳統的分類系統不夠完善，在學名的使用上較混亂，文獻中常出現同種異名和異種同名。生化技術作為輔助手段已在一些物種的分類中得到了應用，Leung等[1]和Borrmeo等[2]曾報道一些寄主上的梨孢菌的可溶性蛋白、非特異性酯酶、過氧化物同工酶及RFLP譜帶存在穩定的差異，某些寄主上的梨孢菌具有特征性譜帶。但應用分子技術結合形態學、有性階段形成及交互致病性研究，將梨孢菌進行系統分類尚未見報道。不同國家和地區由于生態條件的差異，植被種類及梨孢菌的種群結構不同。廣泛收集具有生態差異的各種寄主上的梨孢菌，進行系統的交互致病性、形態學、蛋白質和DNA分子標記研究，明確不同寄主上的梨孢菌的交互致病性、親緣關系和系統分類學地位，具有真菌分類學上的意義，并在稻瘟病的防治上具有重要的流行學和防治學意義。本文結合浙江省農業科學院植微所真菌病害研究室承擔的浙江省基金和國家攻關項目，開展了梨孢菌的親緣關系分析，為這些真菌的系統分類學研究開展一些基礎性工作。

1 材料與方法

1.1 供試梨孢菌菌株

供試菌株由浙江省農業科學院植微所真菌病害研究室收集和提供，參試菌株梨孢菌(Pyricularia)是一類重要的植物病原菌，共計49個菌株，這些菌株的寄主植物及來源見表1。先將稻節保存的菌株轉移到斜面淀粉酵母培養基上，待菌體活化后，再將斜面培養基上菌絲塊轉移到裝有50 mL Vogel’s液體培養基(培養基配方見參考文獻3)的100 mL三角瓶中，在搖床上(24 ℃，100 r/min)振蕩培養3～4 d，待液體培養基中的菌絲球長得較豐富時，利用真空泵將菌絲體抽濾到濾紙上，菌絲體用無菌水沖洗2遍，控干水分后將菌絲體轉入5 mL的離心管中，保存于-20 ℃冰箱，待用。

表1 參試梨孢菌的寄主植物及菌株來源Table 1 The host plants and collection spots of Pyricularia

1.2 梨孢菌DNA提取和隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析

梨孢菌總DNA提取按參考文獻4方法進行。 梨孢菌RAPD擴增采用MJ梯度PCR儀，反應所需的dNTP、Taq酶、PCR緩沖液和隨機引物均由上海生物工程公司提供。共測試了12條隨機引物(S343、S346、S350、S359、S361、S363、S365、S367、S374、S377、S378、S380)。 PCR反應體系為25 μL，其中dNTP 2 μL，Taq酶0.2 μL (一個單位)，10倍的PCR緩沖液2.5 μL，隨機引物1 μL，模板(樣品)DNA，水18.3 1 μL 。PCR擴增程序為：(1)94 ℃預變性 1 min；(2)94 ℃ 15 s；(3)36 ℃ 30 s；(4)72 ℃ 30 s；(5)從(2)至(4)循環44次；(6) 72 ℃ 下放置5 min；(7)移出后放入4 ℃冰箱中保存。

1.3 RAPD擴增產物的電泳和譜帶分析

在RAPD的擴增產物中各加入5 μL 的0.4%的溴酚藍(含40%蔗糖)混勻，然后進行瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳，點樣量為12 μL，電泳時的電壓大槽為120 V，小槽為80 V。電泳結束后，凝膠在EB染色液中染色30 min，然后將凝膠置于紫外透射儀中進行譜帶觀察，并進行照相。對各樣品出現的譜帶用DPS分析軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 梨孢菌的RAPD電泳譜帶差異及親緣關系分析

利用12個隨機引物對梨孢菌進行DNA的RAPD擴增，其中引物S380對梨孢菌 的RAPD擴增產物的多態性最豐富(圖1)。從DNA電泳譜帶中可以直觀地看出，來自同一種或同一屬或親緣關系相近寄主上的梨孢菌帶型較相似，相反，親緣關系較遠的寄主上的梨孢菌帶型譜帶差異較大，茭白、碎米莎草和馬唐寄主上的梨孢菌的譜帶均非常特異，與牛筋草和狗尾草等其他15種寄主的梨孢菌有較大差異，牛筋草和狗尾草等15種寄主的梨孢菌存在比較多的共有譜帶。

對引物S380擴增的RAPD譜帶進行聚類分析(歐氏距離，離差平方和法，圖2)。結果表明，18種寄主上的49個梨孢菌株可分為5個類群，各類菌株的類內譜帶相似性均在50%以上。來自燕麥、茼草、稗、雀麥、雙穗臂形草、臂形草、象草、羅氏草和鋪地黍的19個菌株為一個類群；牛筋草、龍爪稷、狗尾草、粟寄主上的15個菌株也為一個類群；來自馬唐的11個菌株為一個類群；茭白和碎米莎草寄主上的梨孢菌的譜帶均非常特異，各為一個類型。

3 討論

從隨機擴增多態性DNA(RAPD)電泳譜帶對梨孢菌的親緣關系分析結果可以看出，來自同一種或同一屬或親緣關系相近寄主上的梨孢菌帶型較相似，相反，親緣關系較遠的寄主上的梨孢菌帶型譜帶差異較大，茭白、碎米莎草和馬唐寄主上的梨孢菌的譜帶均非常特異，與牛筋草和狗尾草等其他15種寄主的梨孢菌有較大差異，牛筋草和狗尾草等15種寄主的梨孢菌存在比較多的共有譜帶。研究結果也表明真菌種間或專化型之間的DNA( RAPD譜帶)電泳譜帶差異明顯，而種內生理小種間的帶型差異較小。

DNA分子標記已廣泛應用于真菌的種和專化型分類及親緣關系分析、寄主抗病基因和病菌致病基因的分子標記、病菌生理小種和致病型的區分、真菌或病原菌的遺傳變異和遺傳多樣性等方面的研究[5-8]。利用DNA分子標記進行真菌的種和專化型(病菌對寄主種的專化性)分類已有許多報道，該技術已比較成熟。但利用DNA分子標記區分病菌生理小種(病菌對寄主品種的專化性)和致病型的技術還不夠成熟，雖然也有一些利用分子標記區分病菌生理小種和致病型報道，但也出現了一些相反的報道，這方面的研究有待進一步的完善。

[1]Leung H，Borromeo E S，Bermardo M A，et al. Genetic analysis of virulence in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J]. Phytopathology，1998，78：1227-1233.

[2]Borromeo E S，Nelson R J，Bonman J M，et al. Genetic differentiation among isolates ofPyriculariainfecting rice and weed hosts[J]. Phytopathology，1993，83(4)：393-399.

[3]Vogel H J. A convenient growth medium for Neurospora (medium N)[J]. Microbial Genetics Bulletin，1956，3：42-43.

[4]任衍春，張震，毛雪琴，等. 水稻紋枯菌總DNA提取方法的比較[J]. 浙江農業學報，2011，23(4)：741-747.

[5]周永力，呂國忠，劉偉成，等. 采用PCR-RFLP和RAPD對球殼孢目真菌系統學的研究[J]. 菌物系統，1998，7(2)：160-166.

[6]Ellis M B. More dematicious hyphomycetes[M]. CMI，Kew，1976：170-174，186-189.

[7]Gang D R，Webe D J. 利用逢機增殖DNA片段來分析3種小麥黑穗病菌遺傳變異[J]. 植物學匯刊，1996，37(3)：173-180.

[8]Rossman A Y，Howard Rn J，Vslent B. Pyricularia grisea，the correct name for the rice blast disease fungus[J]. Mycologia，1990，82(4)：509-512.

SuddyonPhylogeneticRelationshipofPyriculariasp.StrainsIsolatedfromDifferentHostWeedsinRiceField

MAO Xue-qin, QIU Hai-ping, ZHANG Zhen, JIANG Hua, CHAI Rong-yao, WANG Jiao-yu,WANG Yan-li, SUN Guo-chang, DU Xin-fa

(State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control，Institute of PlantProtection and Microbiology，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China)

By using Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD) weeds in rice field mark derived from 12 primers,the phylogenetic relationship of 49Pyriculariasp. strains isolated from 18 host were analyzed. The electrophoresis bands of DNA visually showed that belt type ofPyriculariasp. strains derived from the same species,same genera or closely related host was similar. In contrast,belt type ofPyriculariasp. strains derived from distantly related host was quite different.Pyriculariasp. strains belts type derived fromZizanialatifolia,CyperusiriaandDigitariasanguinaliswere very special,and quite different from that of the other 15 hosts includingEleusineindica,Setariaviridis,etc.,presenting more common electrophoresis bands. The results of cluster analysis based on RAPD band using primer S380 showed that 49Pyriculariasp. strains derived from 18 hosts could be divided into 5 types.Quite different RAPD bands existed in inter-species，but little different RAPD bands existed in deferent varieties involved in the same species.

Pyriculariasp.;random amplified polymorphic DNA(RAPD);cluster analysis

S451

A

1003-935X(2012)04-0026-04

2012-11-08

國家自然科學基金(編號：30900933、30970082、31170136)；浙江省自然科學基金(編號：Y3110537)；浙江省重大科技攻關專項(“9410”計劃、“8812”計劃)。

毛雪琴(1976—)，女，浙江龍泉人，助理研究員，主要從事植物病原真菌研究。Tel：(0571)86419061；E-mail：lqmxq155@163.com。

杜新法，副研究員，主要從事植物病原真菌研究。E-mail：duxinfa@yahoo.com.cn。