CD137-CD137L相互作用對ApoE-/-小鼠NFATc1表達的影響*

嚴金川， 楊海兵， 蘇紅玲， 袁 偉， 徐良潔

(江蘇大學附屬醫院心內科， 江蘇 鎮江 212001)

1000-4718(2012)07-1181-06

2012-01-27

2012-04-01

江蘇省科教興衛工程(No.LJ201116)；鎮江市社會發展項目(No.SH2010012)

△通訊作者 Tel: 0511-85026169; E-mail: yanjinchuan@hotmail.com

CD137-CD137L相互作用對ApoE-/-小鼠NFATc1表達的影響*

嚴金川△， 楊海兵， 蘇紅玲， 袁 偉， 徐良潔

(江蘇大學附屬醫院心內科， 江蘇 鎮江 212001)

目的觀察CD137-CD137配體(CD137L)軸對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠活化T細胞核因子胞漿1型(NFATc1)表達的影響。方法ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊模型采用頸動脈硅膠圈植入法；分別采用免疫組化及流式細胞術檢測小鼠頸動脈斑塊及淋巴細胞NFATc1表達；分別應用RT-PCR和流式細胞技術檢測體外培養的小鼠淋巴細胞NFATc1 mRNA和蛋白表達。結果在體情況下應用anti-CD137特異性刺激CD137-CD137L軸后，ApoE-/-小鼠斑塊及脾臟中淋巴細胞NFATc1表達增加；體外培養的淋巴細胞刺激CD137-CD137L軸后，淋巴細胞NFATc1 mRNA和蛋白表達明顯上調，anti-CD137刺激濃度以20 mg/L時作用最強，作用24 h最明顯(P<0.05)。應用Anti-CD137L特異性阻斷CD137-CD137L軸能明顯抑制NFATc1 mRNA及蛋白表達，濃度在20 mg/L時抑制最強，時間為24 h后抑制最佳(P<0.05)。結論ApoE-/-小鼠體內NFATc1的表達受CD137-CD137L軸調控。

CD137； CD137配體； 活化T細胞核因子，胞漿1型； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是動脈血管的慢性非特異性炎癥反應, AS斑塊的發展進程涉及多種炎癥細胞、細胞因子之間的相互作用[1-2]。其中T淋巴細胞的激活是AS發生、發展的中心環節。研究表明，體內存在激活T細胞受體-配體信號通路多種途徑；CD137分子為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體-配體超家族的新成員，該分子與其配體(CD137L)結合具有雙向信號轉導作用，能調節多種免疫細胞的功能，并參與T細胞的活化、增殖及細胞外黏附；眾多資料顯示CD137-CD137L相互作用參與AS斑塊的形成和發展，已經證實人頸動脈斑塊中存在CD137高表達，CD137能加速小鼠AS中炎癥斑塊的進展，敲除CD137基因能抑制載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout,ApoE-/-)小鼠AS斑塊形成[3-4]。動物實驗中也證實刺激CD137-CD137L軸能明顯增強ApoE-/-小鼠斑塊形成，阻斷該軸能抑制AS斑塊形成[5]。活化T細胞核因子胞漿1型(nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1, NFATc1)最初是其在免疫激活中起重要作用而得名，近來發現NFATc1參與了AS的發生。抑制NFATc1活性能抑制平滑肌的增殖從而阻遏粥樣斑塊的形成[6-7]。因此，我們推測NFATc1可能是CD137-CD137L軸調控的下游分子。為證實這一設想，我們采用ApoE-/-小鼠AS斑塊模型，分別在體內、外刺激和阻斷CD137-CD137L軸后，觀察NFATc1表達是否受該軸的調控。

材 料 和 方 法

1試劑及動物

實驗用ApoE-/-小鼠，體重約20 g，6周齡，購自北京大學動物實驗中心。Foxp3 Staining Buffer Set和anti-CD3e、anti-mouse CD137和anti-mouse CD137L抗體購自eBioscience。Anti-NFATc1 monoclonal antibody購自Santa Cruz，mouse CD4-PE、FITC標記Ⅱ抗和同型對照IgG2b購自Multisciences。Trizol mRNA提取液和PCR上、下游引物為上海Sangon生物工程公司產品。逆轉錄試劑盒及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒均購自TaKaRa，RPMI-1640為Gibco產品。

2ApoE-/-斑塊模型的制作及檢測

取6周大小ApoE-/-小鼠(該小鼠具有自發形成AS傾向)[8]麻醉后，分離頸總動脈，應用頸動脈硅膠圈植入法快速制作斑塊模型[9]。硅膠圈(Dow Corning Corporation)內徑為0.3 mm，小鼠頸動脈在80 mmHg灌注壓下，頸總動脈的外徑平均為0.36 mm，因此使用硅膠圈，可使頸總動脈狹窄30%，高脂飲食喂養2周后可形成明顯斑塊。術后經高脂飼料喂養2、4、6周及予以抗體干預后，分別手術取下頸動脈，行HE常規染色，觀察頸動脈內粥樣斑塊的變化。

3體內干預CD137-CD137L軸

3.1實驗分組 小鼠分為3組：(1)對照組(模型組)；(2)刺激組(每只小鼠腹腔注射anti-CD137 200 μg, 每周1次, 連續6周)；(3)抑制組(每只小鼠腹腔注射anti-CD137L 200 μg, 每周1次, 連續6周)。

3.2ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊中NFATc1表達 免疫組化檢測小鼠頸動脈斑塊NFATc1表達；結果判斷依據陽性細胞密度及顯色強度計算。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，各計數細胞100個，計算NFATc1陽性細胞百分率。陽性細胞少于5%記0分；占5%～25%記1分；占26%～49%記2分；占50%～75%記3分；大于75%記4分。顯色強度記0～3分：細胞內無著色記0分；細胞內淡黃色記1分；棕黃色記2分；棕褐色記3分；將2項指標評分相加，分4級，即陰性(-)為0～1分；弱陽性(+)為2～3分；中等陽性(++)4～5分；強陽性(+++)大于5分。陰性無表達，弱陽性為低表達，強陽性為高表達。

3.3ApoE-/-小鼠脾臟淋巴細胞表達NFATc1 取脾臟制備單個淋巴細胞懸液，將細胞懸于PBS中，加CD4-PE抗體0.25 μL，4 ℃下孵育30 min，PBS洗2次后，加入0.5 mL破膜劑，4 ℃下孵育30 min，破膜緩沖液洗2次，加NFATc1抗體5 μL(其中一管加1 μL IgG2b作同型對照即陰性對照)，4 ℃下孵育1.5 h，破膜緩沖液洗2次，加FITC標記Ⅱ抗1 μL，4 ℃下孵育1.5 h，洗滌后將細胞重懸于0.3 mL PBS中，流式細胞檢測并分析。

4體外培養的細胞中干預CD137-CD137L軸

無菌取出小鼠脾臟，剪碎后置于有PBS篩網中輕柔研磨，將研磨液于離心管中離心(4 ℃、500×g離心5 min)，棄上清加Ficoll液密度梯度離心法分離淋巴細胞，用PBS將所得細胞沉淀洗滌2遍，計數后RPMI-1640培養液配置成2×109/L的單個淋巴細胞懸液。取細胞懸液置6孔板(6孔板已用10 mg/L anti-CD3e抗體4 ℃包被過夜)，設3組：(1)對照組(不加抗體組)；(2) anti-CD137 刺激組(10、20、30 mg/L)；(3) anti-CD137L抑制組(10、20、30 mg/L)。在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育，分別作用8 h、12 h、24 h、36 h收獲細胞用于NFATc1 mRNA和蛋白的檢測。

5RT-PCR檢測淋巴細胞NFATc1mRNA及蛋白表達

按RT-PCR試劑盒提供的方法進行，NFATc1 上游引物5’-GTGGCAGCCATCAACGCCCT-3’，下游引物5’-TACGAGGCCTGTGGCACCGA-3’，產物大小為241 bp。β-actin上游引物5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’，下游引物5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’，產物大小為349 bp。RT- PCR擴增條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，NFATc1進行40個循環，β-actin進行35個循環。結果采用2-ΔΔCt分析。NFATc1蛋白表達采用流式細胞術檢測，實驗步驟同上。

6統計學處理

結 果

1ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊形態觀察

正常對照組頸動脈內膜光滑平整，管壁呈半透明狀；無脂紋和斑塊形成，彈力板完整。術后動脈粥樣斑塊模型小鼠有明顯斑塊形成，含大量泡沫細胞，富含脂質，可見膽固醇結晶，彈力板變性、斷裂，而術后給予anti-CD137刺激劑后斑塊更顯著，術后給予anti-CD137L抑制劑后斑塊較少，見圖1。

2體內干預CD137-CD137L軸后頸動脈斑塊及淋巴細胞表達NFATc1變化

體內給予anti-CD137刺激CD137-CD137L軸后，免疫組化及流式細胞術檢測均顯示ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊及脾臟淋巴細胞中NFATc1表達明顯較對照組強； 而應用anti-CD137L抑制該軸后，ApoE-/-小鼠斑塊及脾臟淋巴細胞中NFATc1表達顯著減弱，見圖2、表1和圖3。

Figure 1. Mouse carotid sections (HE staining, ×100). A: normal control;B: 2 weeks after carotid collar placement; C: 4 weeks after carotid collar placement;D: 6 weeks after carotid collar placement; E: after carotid collar placement, 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137L;F: after carotid collar placement, 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137.

圖1小鼠頸動脈切片HE染色

Figure 2. The expression of NFATc1 in the carotid atherosclerotic plaques ofApoE-/-mice in each group (immunohistochemical staining, ×100). A: normal control; B: control, 6 weeks after carotid collar placement; C: stimulation, carotid collar placement and 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137; D: inhibition, carotid collar placement and 6-week treatment with intraperitoneal injection of anti-CD137L.

圖2各組ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊內NFATc1表達強度

表1 各組ApoE-/-小鼠斑塊中NFATc1免疫組化分析結果

*P<0.05vscontrol.

圖3流式細胞術檢測小鼠脾臟淋巴細胞NFATc1表達

3體外刺激CD137-CD137L軸對淋巴細胞NFATc1mRNA及蛋白表達影響

如圖4所示，與對照組相比，使用anti-CD137刺激CD137-CD137L軸后，淋巴細胞NFATc1 mRNA表達上調，以20 mg/L刺激最顯著，呈時間依賴性，24 h作用最明顯。不同濃度anti-CD137作用24 h后，NFATc1 mRNA表達均明顯上調，以20 mg/L濃度最佳(P<0.05),見圖4A。以20 mg/L anti-CD137刺激細胞不同時間后，NFATc1蛋白表達在24 h明顯升高，36 h下降，見圖4B、C。

4體外抑制CD137-CD137L軸對淋巴細胞NFATc1mRNA及蛋白表達影響

如圖5所示，與對照組相比，使用抑制型anti-CD137L抑制CD137-CD137L軸后，NFATc1 mRNA表達下調，以20 mg/L最顯著，呈時間依賴性，在24 h作用最明顯，36 h后作用減弱。不同濃度anti-CD137L作用24 h后，NFATc1 mRNA表達均明顯下調，20 mg/L濃度最顯著(P<0.05),見圖5A。以20 mg/L anti-CD137L抑制細胞不同時間后，NFATc1蛋白表達明顯下降，在24 h最顯著,見圖5B、C。

討 論

AS是由多種復雜因素及免疫系統參與的慢性非特異性炎癥，包括炎癥細胞浸潤和脂質沉積，其中炎癥細胞的相互作用起關鍵作用，特別是T淋巴細胞介導的免疫應答是一系列炎癥反應的中心環節[10]，在AS的形成及斑塊進展中起關鍵作用。T細胞識別抗原依賴T細胞表面的膜蛋白分子及其配體介導的共刺激信號。近年來，通過調控T細胞共刺激物，抑制T細胞介導的炎癥反應，達到延緩AS發生、發展已經成為當前的研究熱點。CD137-CD137L作為激活T細胞信號通路的一對關鍵共刺激分子，在促進T細胞的增殖和分化、介導T細胞和內皮細胞間的黏附、調節巨噬細胞抗原遞呈功能中發揮重要作用。CD137在人類AS斑塊中高表達，CD137-CD137L相互作用能加速AS炎癥斑塊的進展，在CD137基因表達缺陷及單抗封閉CD137L的小鼠均可發現AS斑塊面積明顯減少，眾多研究表明CD137-CD137L軸可能是致AS形成的一個信號級聯反應，能促進AS斑塊的進展，影響斑塊的穩定性。

圖4刺激CD137-CD137L軸對體外培養的小鼠脾臟淋巴細胞NFATc1mRNA和蛋白相對表達量的影響

圖5阻斷CD137-CD137L軸對體外培養的小鼠脾臟淋巴細胞NFATc1mRNA和蛋白相對表達量的影響

NFAT是一類至關重要的核轉錄因子，調節多種細胞因子的轉錄水平，參與免疫應答調節、T細胞生長分化等。NFATc1是NFAT家族重要成員之一，最初是其在免疫激活中起重要作用而得名，在外周淋巴細胞中編碼相應的蛋白合成，在活化的T細胞和NK細胞中NFATc1表達上調。近年來發現NFATc1參與心血管疾病的發生，抑制NFATc1活性能抑制平滑肌的增殖從而抑制粥樣斑塊形成。我們體內也證實CD137高表達與冠脈斑塊不穩定相關[11-12]，因此，我們推測NFATc1是受CD137-CD137L調控動脈粥樣斑塊進展的下游分子。

本實驗中，我們從體內、體外兩方面分別刺激和抑制CD137-CD137L軸，觀察小鼠NFATc1表達的變化。體外采用ApoE-/-鼠頸動脈硅膠圈植入法快速制作AS斑塊模型，明確AS斑塊形成的前提下，取未經治療的ApoE-/-小鼠脾臟淋巴細胞體外培養，應用刺激型anti-CD137和抑制型anti-CD137L分別干預CD137-CD137L軸；體內實驗顯示ApoE-/-小鼠腹腔注射刺激型anti-CD137后，斑塊及脾臟淋巴細胞中NFATc1表達明顯增強，而抑制型anti-CD137L干預后；斑塊及淋巴細胞中NFATc1表達受到抑制。體外培養ApoE-/-小鼠淋巴細胞后，應用激發型CD137單抗刺激CD137-CD137L軸，進而在體外可進一步擴增活化的T細胞，使胞漿Ca2+濃度升高，啟動促分裂素原活化蛋白激酶(MAP激酶)級聯反應，使NFATc1在核內表達增加。CD137L單抗與抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)或B細胞上的CD137L有較強的結合能力，能有效封閉CD137與CD137L的相互作用，阻斷共刺激信號傳遞，NFATc1表達下降。上述結果提示，體內、外刺激和阻斷CD137-CD137L軸可在轉錄及蛋白翻譯水平調控ApoE-/-小鼠NFATc1表達。而體外實驗所用的淋巴細胞采自未經治療的ApoE-/-動脈粥樣斑塊模型小鼠，使得實驗得以在動脈粥樣硬化疾病的背景下進行，也就進一步證實NFATc1是受CD137-CD137L調控動脈粥樣斑塊進展的下游分子。盡管體內注射CD137抗體可能會引起小鼠免疫系統功能紊亂，但這一動物模型及實驗方法對了解CD137-CD137L在AS的作用和相關機制提供了很多幫助。

AS的發生受局部炎癥刺激及全身炎癥反應的影響，目前大多數實驗是從局部炎癥刺激角度探討AS的源頭機制，本研究在明確CD137-CD137L參與AS斑塊進展的前提下，從全身炎癥反應的角度出發，證實NFATc1是CD137-CD137L信號活化的下游分子。該結果為我們設想能夠將AS炎癥反應抑制在信號活化階段，高效預防AS的發生與發展，并為阻斷CD137-CD137L通路防治冠心病提供新的源頭防治靶點。

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EffectofCD137-CD137ligandinteractiononexpressionofNFATc1inapolipoproteinE-deficientmice

YAN Jin-chuan, YANG Hai-bing, SU Hong-ling, YUAN Wei, XU Liang-jie

(DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China.E-mail:yanjinchuan@hotmail.com)

AIM: To observe the effects of CD137-CD137 ligand(CD137L) interaction on the nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 (NFATc1) in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.METHODSAtherosclerotic plaque model was produced by perivascular carotid collar placement inApoE-/-mice.Invivo, the expression levels of NFATc1 in mouse plaques and lymphocytes were detected by immunohistochemical method and flow cytometry, respectively.Invitro, the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in cultured lymphocytes ofApoE-/-mice was measured by RT-PCR and flow cytometry, respectively.RESULTSInvivo, after CD137-CD137L signaling pathway was stimulated, the expression of NFATc1 was significantly increased in the atherosclerotic plaques and lymphocytes.Invitro, the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in cultured leukocytes ofApoE-/-mice was also significantly increased, with the maximal effect exerted by anti-CD137 monoclonal antibody (mAb) at the concentration of 20 mg/L, and 24 h after stimulation at any concentration (P<0.05). Anti-CD137L mAb significantly inhibited the expression of NFATc1 at mRNA and protein levels in the lymphocytes ofApoE-/-mice, with the maximal effect exerted by anti-CD137L mAb at the concentration of 20 mg/L, and 24 h after stimulation (P<0.05).CONCLUSIONCD137-CD137L interaction can regulate the expression of NFATc1 inApoE-/-mice.

CD137; CD137 ligand; Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1; Atherosclerosis

R392.12

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.006