細胞自噬對饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細胞的保護作用*

江立波， 張小磊， 徐華梓， 吳瑞凱， 楊光永， 吳 畏， 胡旭琪， 鄭旭浩

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院脊柱外科, 浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)07-1302-06

2012-01-16

2012-03-28

浙江省“重中之重”學(xué)科開放基金資助項目(No. 2011GK001)

△通訊作者 Tel：0577-88002854；E-mail：spinexu@163.com

細胞自噬對饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細胞的保護作用*

江立波， 張小磊， 徐華梓△， 吳瑞凱， 楊光永， 吳 畏， 胡旭琪， 鄭旭浩

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院脊柱外科, 浙江 溫州 325000)

目的探討?zhàn)囸I條件下椎間盤髓核細胞是否發(fā)生自噬及自噬對髓核細胞的作用。方法原代培養(yǎng)SD大鼠髓核細胞，對細胞表型進行鑒定后，將細胞分為正常對照組、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)加DMEM培養(yǎng)基組、3-MA加EBSS培養(yǎng)基組和EBSS饑餓組，接著用單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色、透射電鏡和Western blotting觀察各組細胞的自噬差異，最后采用CCK-8法測定細胞生長抑制率以及TUNEL法測定細胞凋亡率。結(jié)果成功培養(yǎng)出SD大鼠髓核細胞。與對照組相比，電鏡和熒光顯微鏡下觀察到EBSS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的髓核細胞出現(xiàn)自噬囊泡，但是3-MA 抑制后細胞自噬泡明顯減少；Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)LC3-II/LC3-I和Beclin-1/β-actin在EBSS處理組明顯大于3-MA+EBSS處理組和對照組(P<0.05), 而3-MA+EBSS處理組的細胞抑制率和凋亡率明顯高于EBSS處理組(P<0.05)。結(jié)論饑餓可以誘導(dǎo)大鼠椎間盤髓核細胞發(fā)生自噬，并且3-MA能抑制自噬發(fā)生。自噬對饑餓環(huán)境下的髓核細胞可能具有一定的保護作用。

髓核細胞; 自噬; 細胞凋亡; 饑餓

椎間盤退變往往伴隨著椎間盤細胞數(shù)目的減少和活性的降低，同時髓核細胞的減少影響了細胞外蛋白多糖和II型膠原的代謝平衡，這已經(jīng)被許多文獻所認可[1-2]。哺乳動物細胞有3種死亡方式，分別為壞死、凋亡和新發(fā)現(xiàn)的自噬，而凋亡已被認為與椎間盤的退變有密切的聯(lián)系[1]，可是細胞自噬在椎間盤領(lǐng)域的研究目前仍然較少。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SD大鼠的纖維環(huán)細胞經(jīng)無血清饑餓誘導(dǎo)后有自噬現(xiàn)象[2]，而椎間盤髓核細胞的自噬現(xiàn)象及其作用尚未有明確的研究，因此本實驗通過對髓核細胞進行饑餓誘導(dǎo)的方法來觀察髓核細胞的自噬現(xiàn)象及其對細胞的作用。

材 料 和 方 法

1材料

DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco)，Eagle’s balanced salt solution(EBSS)及II型膠原酶(Gibco),3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA;Sigma),TUNEL凋亡檢測試劑盒(Roche)，單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)熒光染料(Gibco)，Cell Counting Kit-8(CCK-8;Dojind)、RIPA 細胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及ECL發(fā)光液(上海碧云天公司)，LC3、Beclin-1及β-actin兔抗大鼠多克隆抗體(CST),羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(北京康為世紀公司)，SD大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供，許可證號為SCXK(浙)2010-0044。

2細胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

取約150 g重的SD大鼠，無菌環(huán)境下取出整個腰椎，移至細胞房用10倍顯微鏡將膠凍狀的髓核細胞取出，見圖1，置于含有1%青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，將5只SD大鼠的髓核聚集起來，洗凈后，將髓核組織轉(zhuǎn)移到離心管中，用0.1%II型膠原酶和2 kU/L透明質(zhì)酸酶消化4 h，離心后用吸管將組織種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，2 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含1×105U/L青霉素、2 mmol/L谷氨酰胺，100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。當(dāng)原代細胞在培養(yǎng)瓶中達到80%融合時，用0.25%胰酶傳代以3×105細胞接種于6孔板中爬片，待細胞貼壁以后進行II型膠原免疫細胞化學(xué)染色、甲苯胺藍染色及阿利新藍染色。

Figure 1. The process of separating gel-like nucleus pulposus from the anulus fibrosus under dissecting microscope.A:the intact intervertebral disc;B:the gel-like nucleus pulposus was isolated from the intervertebral disc when the endplate was cut off by the scissors.

圖1顯微鏡下分離膠凍樣髓核組織的過程

3細胞的分組及處理

所用細胞均為第2代細胞，實驗均重復(fù)3次以上，分組為： (1) 對照組(A組)：用上述的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)髓核細胞； (2)3-MA+DMEM組(B組)：含有10 mmol/L 3-MA的上述DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2 h; (3)3-MA+EBSS(C組)：首先用含有10 mmol/L 3-MA的上述DMEM培養(yǎng)液處理預(yù)處理細胞1 h，之后換用含有10 mmol/L 3-MA的EBSS平衡鹽饑餓髓核細胞2 h； (4) EBSS(D組)：用EBSS平衡鹽溶液饑餓細胞2 h。

4細胞自噬的鑒定

4.1MDC熒光染色鑒定髓核細胞的自噬泡 采用Biederbick等[3]實驗方法，將各組細胞爬片進行處理后，去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，用0.05 mmol/L MDC染料于37 ℃孵育細胞60 min，吸去染料后用4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗2次，晾干后立刻用熒光顯微鏡觀察，激發(fā)濾片為365 nm，阻斷濾片為430 nm。在200倍視野下，隨即取100個細胞，計數(shù)含有點狀自噬泡的細胞，并計算自噬細胞比率=含自噬泡的細胞/100個細胞，重復(fù)3次 ,計算平均值。

4.2透射電鏡觀察髓核細胞的自噬現(xiàn)象 各組取2瓶細胞，分別進行處理并離心成團，在EP管中2%戊二醛4 ℃固定過夜，PBS漂洗，1%鋨酸固定，醋酸鈾染色，梯度丙酮脫水，預(yù)包埋，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片及甲苯胺藍染色進行定位，LKB-V超薄切片機超薄切片，透射電鏡下觀察髓核細胞。

4.3Western blotting檢測髓核細胞的LC3和Beclin-1蛋白的表達 在6孔板中將各組細胞用PBS洗2遍后，用蛋白提取緩沖液RIPA(radioimmunoprepciption assay)和蛋白酶抑制劑PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)提取細胞的蛋白，BCA法測定總濃度大小，SDS-PAGE電泳，將LC3目的蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm大小的PVGF膜上，而Beclin-1和內(nèi)參照則轉(zhuǎn)至0.45μm的膜上，封閉，孵LC3抗體(1∶500)、Beclin-1抗體(1∶500)及β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶2 500)，常規(guī)ECL發(fā)光液顯色。

5細胞生長活性及凋亡水平的檢測

5.1CCK-8法測定各組細胞的抑制率 取對數(shù)期細胞，將濃度為5×1010/L的細胞接種到96孔板中，每孔為100 μL,每組設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)不含細胞的DMEM和EBSS分別作為本底值，A組為空白對照組，各組在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后使其貼壁，用PBS清洗后，分別換用100 μL的不同培養(yǎng)液后,孵育1 h，加入CCK-8反應(yīng)液10 μL, 于37 ℃下再孵育1 h，總共處理時間為2 h，用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值，按下列公式計算細胞生長抑制率：B組細胞生長抑制率= (空白對照組A值-實驗組A值)/(空白對照組A值-DMEMA值)，C、D組細胞生長抑制率= [(空白對照組A值-DMEMA值)-(實驗組A值-EBSSA值) ]/(空白對照組A值-DMEMA值)。

5.2TUNEL熒光比較不同組的凋亡水平 將細胞爬片按照分組進行不同的處理后，吸取處理液后用10%多聚甲醛固定細胞30 min,再加入0.1%Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min,按TUNEL凋亡試劑盒說明進行操作后熒光顯微鏡下觀察細胞。在200倍視野下數(shù)細胞總數(shù)，熒光下數(shù)凋亡細胞數(shù)目，重復(fù)取3個視野，取平均值，計算髓核細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/視野下細胞總數(shù)。

6統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1細胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定

椎間盤髓核細胞大多為多角形或者梭形，有較長的突起，可以跨越幾個細胞的長度，顆粒狀的細胞質(zhì)，細胞質(zhì)中有分布較大的囊泡，原代培養(yǎng)15 d左右達到融合狀態(tài)，傳代次數(shù)增多后細胞逐漸呈長梭形。原代中同時看到圓形的、大于髓核細胞的脊索細胞，內(nèi)含大量空泡狀結(jié)構(gòu)，并且?guī)缀醪辉鲋常車凰笮渭毎@。II型膠原免疫細胞化學(xué)染色可見細胞胞質(zhì)中棕黃色的顆粒，以核周為著；甲苯胺藍染色可見細胞胞質(zhì)異染成紫色；阿利新藍染色可見細胞質(zhì)染成淡藍色，見圖2。上述實驗結(jié)果證明了本實驗的細胞為髓核的類軟骨樣細胞。

Figure 2. The morphological presentation of nucleus pulposus cells (×200). A： under phase-contrast microscope; B: toluidine blue staining;C: Alcian blue staining;D: immunocytochemical staining for type II collagen.

圖2髓核細胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2MDC熒光染色觀察各組髓核細胞的自噬泡

熒光顯微鏡下可見D組細胞吸收MDC染料，從而較多細胞均含有大量點狀藍綠色熒光結(jié)構(gòu)，主要分布在核周圍，而C組含藍綠色點狀物質(zhì)的細胞較D組明顯減少(且細胞內(nèi)的點狀結(jié)構(gòu)密度也明顯降低)，A組和B組的細胞內(nèi)均無明顯的自噬泡出現(xiàn)，見圖3。計算A、B、C和D組的自噬細胞百分率分別為(4.9±1.2)%、(4.7±1.0)%、(11.1±1.7)%和(67.7±8.8)%， D組與A、B、C組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而A、B、C各組之間無明顯差異(P>0.05)。

Figure 3. MDC staining of the autophagic vacuoles in nucleus pulposus cells(×400).A:control;B:3-MA+DMEM;C:3-MA+EBSS;D:EBSS.

圖3髓核細胞MDC熒光染色

3電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

A組髓核細胞大小約為10 μm，細胞核呈圓形，核膜完整，無明顯切跡，胞漿內(nèi)清晰可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和散在的致密糖原顆粒；B組細胞超微形態(tài)與A組細胞相似；C組可見細胞明顯固縮，較正常髓核細胞小，細胞核亦逐漸固縮，染色質(zhì)濃集，電子密度增高，并且形成凋亡小體，偶爾亦可見自噬泡，同時可以看到部分細胞壞死，細胞漿崩解，沒有完整細胞膜結(jié)構(gòu)。D組可見細胞核仍然呈圓形，并無明顯固縮，但是細胞漿內(nèi)可見大量囊泡狀結(jié)構(gòu)，在高倍鏡下可見雙層膜結(jié)構(gòu)，將各種蛋白質(zhì)或者細胞器包裹，見圖4。

Figure 4. Electron micrographs of nucleus pulposus cells.A:a normal cell; B: the autophagosomes with double-limiting membrane in nucleus pulposus cells of EBSS treatment group; C：apoptotic changes including cell condensation and apoptoic body in 3-MA+EBSS group; D: necrotic cells in 3-MA+EBSS group.

圖4髓核細胞的電鏡下表現(xiàn)

4各組細胞的LC3和Beclin-1的蛋白表達水平

Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)D組細胞的LC3-II/LC3- I和 Beclin-1/β-actin的灰度值明顯大于A、B和C組(P<0.05)，并且C組的LC3-II/LC3- I灰度值比A組和B組大(P<0.05)， Beclin-1/β-actin值在A、B、C組中均無明顯差異(P>0.05),見圖5。

5各組細胞的生長抑制率

A、B、C和D組的細胞生長抑制率分別為0、(1.71±1.05)%、(62.69±6.39)%和(33.39±4.59)%，A組和B組的抑制率無明顯差異(P>0.05)， C組細胞生長抑制率明顯大于其余各組(P<0.05)，同時D組亦大于A組和B組(P<0.05)，見圖6。

6各組細胞的凋亡水平比較

TUNEL熒光染色可見C組有較多陽性細胞，D組相對較少，而A組和B組幾乎沒有陽性細胞。C組的髓核細胞凋亡率為33.41%，明顯高于D組的15.53%(P<0.05)，而A組和B組幾乎沒有細胞發(fā)生凋亡，見圖7。

討 論

細胞自噬通過自噬泡與溶酶體結(jié)合來降解細胞內(nèi)老化和損壞的細胞器以及錯構(gòu)和多余的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生新的氨基酸和能量，進而參與細胞的各種病理生理過程，這是一種相對保守的機制[4]。細胞自噬往往與老年性疾病有密切聯(lián)系，Carames等[5]證實人類骨關(guān)節(jié)炎和小鼠的關(guān)節(jié)炎模型與自噬密切相關(guān)，并且自噬可能對骨關(guān)節(jié)炎具有保護作用，Ye等[6]人亦證實在大鼠退變的椎間盤中存在自噬現(xiàn)象。椎間盤退變亦作為一種年齡相關(guān)性疾病，目前尚不清楚細胞自噬在椎間盤退變中的具體機制。

圖5各組細胞的LC3和Beclin-1蛋白的表達

圖6CCK-8法測定各組細胞的生長抑制率

細胞周圍環(huán)境的改變可以引起細胞的各種應(yīng)激反應(yīng)，而細胞的應(yīng)激反應(yīng)會上調(diào)自噬水平。將細胞進行各種物質(zhì)的饑餓，如氨基酸、生長因子、氧氣、能量等，均可以引起細胞自噬，但是最能提高細胞自噬水平的是氨基酸[7]，如本實驗所用的EBSS培養(yǎng)基就是無氨基酸的培養(yǎng)基。因為細胞自噬通過降解胞漿中的老化蛋白質(zhì)和細胞器而為細胞和細胞周圍環(huán)境補充新的氨基酸，如果降低周圍環(huán)境中的氨基酸的總量，細胞則通過提高自噬水平來負反饋增加細胞周圍環(huán)境中氨基酸的含量，而這些氨基酸主要用來合成那些適應(yīng)饑餓的蛋白質(zhì)，如溶酶體酶、氧化呼吸鏈上的蛋白以及抗氧化酶等等[8]。本實驗通過電鏡、MDC觀察到了髓核細胞雙層膜結(jié)構(gòu)自噬囊泡的形成，并且運用Western blotting檢測到自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3- I和 Beclin-1/β-actin較對照組有顯著升高，因此作者從多方面證實了無氨基酸的EBSS培養(yǎng)基可以顯著提高大鼠椎間盤髓核細胞的自噬水平，這與其它哺乳動物的細胞相似[2]。

圖7各組細胞的TUNEL熒光染色及凋亡率

Shen等[2]證實椎間盤纖維環(huán)細胞在無血清饑餓環(huán)境下存在24 h后出現(xiàn)自噬現(xiàn)象，但是細胞自噬是對周圍環(huán)境改變的快速反應(yīng)過程，往往只需要幾小時，并且細胞自噬是一個動態(tài)的過程，自噬流(autophagy flux)會隨著時間而發(fā)生改變[9]。本實驗用EBSS培養(yǎng)基只將髓核細胞饑餓2h，能夠較為準確地在自噬流高峰期進行檢測。椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)主要依靠終板的滲透和外層纖維環(huán)的血供，因此椎間盤退變時終板的鈣化主要導(dǎo)致髓核細胞的營養(yǎng)缺乏，使得髓核細胞處于一種相對饑餓的狀態(tài)；并且伴隨椎間盤退變的主要是髓核細胞的減少和活性降低，因此本文以饑餓髓核細胞2 h為研究手段可以更好地探討體內(nèi)椎間盤營養(yǎng)缺乏時對于髓核細胞自噬的影響，從而為揭露細胞自噬在椎間盤退變中的作用提供一定的基礎(chǔ)。

電鏡是證明自噬和凋亡現(xiàn)象的金標準，我們通過電鏡在饑餓的髓核細胞中同時觀察到了自噬和凋亡現(xiàn)象。自噬和凋亡起源于同一上游信號通路，在各種環(huán)境下通過Bcl-2、Bax和Beclin-1的相互結(jié)合和磷酸化，調(diào)節(jié)凋亡和自噬的各自主導(dǎo)優(yōu)勢，如在饑餓的環(huán)境下，Bcl-2發(fā)生磷酸化并與Beclin-1分離，在Beclin-1作用下細胞逐漸形成大量的自噬泡，對細胞和組織進行保護，并且通過磷酸化的Bcl-2與Bax結(jié)合來降低細胞的凋亡水平[10-11]。我們將大鼠的髓核細胞在無氨基酸的EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，成功地誘導(dǎo)出自噬現(xiàn)象，另外用自噬特異性抑制劑3-MA處理饑餓細胞后成功地部分抑制了細胞的自噬，但是細胞的凋亡和抑制率反而增加了，而設(shè)立的3-MA+DMEM組并沒有發(fā)現(xiàn)3-MA能誘導(dǎo)正常環(huán)境下的髓核細胞發(fā)生凋亡或?qū)λ韬思毎种谱饔茫虼碎g接地證明了一定限度的細胞自噬可以抑制饑餓環(huán)境中髓核細胞的死亡，進而對髓核細胞進行保護。體內(nèi)退變的髓核細胞亦處于營養(yǎng)缺乏的環(huán)境，并且也有研究證明了退變的髓核細胞中存在自噬現(xiàn)象[6]，但是體內(nèi)椎間盤的自噬現(xiàn)象是否與椎間盤的營養(yǎng)缺乏有關(guān)，細胞自噬對退變的椎間盤到底有什么樣的作用？這些均需要進一步探索。

細胞凋亡已經(jīng)被認為是參與椎間盤退變的重要因素之一，Ha等[12]通過體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在退變的椎間盤髓核和終板中細胞凋亡率明顯高于正常椎間盤，并且Sudo等[13]通過siRNA的方法抑制細胞凋亡可以緩解椎間盤退變。本研究間接地發(fā)現(xiàn)髓核細胞的自噬亦可以抑制饑餓誘導(dǎo)的細胞凋亡，雖然體外培養(yǎng)的細胞與體內(nèi)的細胞具有較大差異性，但是本文為未來椎間盤的治療和具體機制的闡述可以提供一定的基礎(chǔ)。

在饑餓環(huán)境下，自噬通過降解細胞器和蛋白質(zhì)為細胞提供能量、氨基酸，從而保護細胞應(yīng)付周圍環(huán)境。但是在一定條件下，過度的細胞自噬亦會導(dǎo)致細胞發(fā)生程序性死亡——自噬死亡[14]，如Xue等[15]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)生長因子撤退的情況下，自噬可能介導(dǎo)了神經(jīng)元細胞的死亡。本文所使用的EBSS培養(yǎng)基是常規(guī)誘導(dǎo)細胞自噬的環(huán)境，將髓核細胞饑餓2h并未引起細胞大量的自噬死亡，因此這個誘導(dǎo)自噬的模型能夠較為可靠地研究髓核細胞的自噬。但是細胞自噬是一把雙刃劍，隨著饑餓時間的延長，細胞自噬對髓核細胞的影響尚需要進一步的研究。

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Protectiveeffectofautophagyonnucleuspulposuscellsunderstarvation

JIANG Li-bo, ZHANG Xiao-lei, XU Hua-zi, WU Rui-kai, YANG Guang-yong, WU Wei, HU Xu-qi, ZHENG Xu-hao

(DepartmentofSpineSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:spinexu@163.com)

AIM: To explore the possibility that the starvation environment induces autophagy of nucleus pulposus cells.METHODSPrimary rat nucleus pulposus cells was cultured and stained with toluidine blue, Alcian blue and immunocytochemistry for typeⅡ collagen. The cultured cells were divided into 4 groups: control group, 3-methyladenine (3-MA)+DMEM group, 3-MA+EBSS group and EBSS group. The cells were detected for autophay using monodansylcadaverine (MDC) staining, electron microscopy and Western blotting. At the same time, the inhibitory rate and apoptotic rate of the cells were detected by Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay and TUNEL staining, respectively.RESULTSCompared with control group, the autophagosomes were observed in nucleus pulposus cells under electron microscope and fluorescence microscope in EBSS group, and the 3-MA+EBSS treatment suppressed the formation of autophagosomes. The results of Western blotting analysis showed that the ratios of LC3-II/LC3- I and Beclin-1/β-actin in EBSS treatment group were higher than those in control group and 3-MA+EBSS treatment group. However, the apoptotic rate of nucleus pulposus cells and the inhibitory rate of cell viability were increased in 3-MA+EBSS treatment group.CONCLUSIONAutophagy of nucleus pulposus cells is induced by nutrient starvation, and 3-MA suppresses the response. Autophagy may have a protective effect on nucleus pulposus cells under the condition of starvation.

Nucleus pulposus cells; Autophagy; Apoptosis; Hunger

R329.25

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.028