HRM技術在瘦素基因啟動子多態性與肝硬化發生相互關系研究中的應用*

李善高, 曹海軍, 劉 軍, 徐國萍, 孫明洪, 朱孝鴻, 呂 賓, 孟立娜

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院 1消化內科， 3 檢驗科， 4肝病科，浙江 杭州 310006；2中國計量學院生命科學學院，浙江 杭州 310018)

1000-4718(2012)07-1308-06

2011-12-20

2012-03-08

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2100379)

△通訊作者 Tel:0571-86919331;E-mail:galisga@yahoo.com.cn

HRM技術在瘦素基因啟動子多態性與肝硬化發生相互關系研究中的應用*

李善高1△, 曹海軍1, 劉 軍2, 徐國萍1, 孫明洪3, 朱孝鴻4, 呂 賓1, 孟立娜1

(浙江中醫藥大學附屬第一醫院1消化內科，3檢驗科，4肝病科，浙江 杭州 310006；2中國計量學院生命科學學院，浙江 杭州 310018)

目的探討PCR-高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術篩選和分析肝硬化患者瘦素基因啟動子C2549和G2548位點突變的可能性，同時研究突變基因型與肝硬化患者生理生化指標之間的關系。方法采用PCR-HRM新型技術，同時對比傳統方法PCR-限制性片段長度多態性分析(RFLP)，對對照組(n=100)和肝硬化組(n=100)瘦素基因啟動子C2549和G2548位點突變進行分析，同時檢測生理生化指標。結果(1)PCR-HRMA技術能夠有效、高通量、準確地實現對瘦素基因啟動子多態性的檢測； (2)肝硬化患者瘦素基因啟動子主要突變位點在C2549，而G2548位點沒有發現突變；(3)肝硬化組中瘦素、游離瘦素指數(FLI)、空腹胰島素(FINS)和胰島素抵抗指數(HOMA-IR)高于對照組，胰島素敏感指數(ISI)及可溶性瘦素受體(sOB-R)低于對照組，除瘦素外，均有顯著差異(P<0.05)；FLI與FINS和HOMA-IR呈正相關(r=0.45、r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負相關(r=-0.34,P<0.05)；(4)肝硬化患者C2549雜合型占優勢，肝硬化純合型和雜合型突變個體中 HOMI-IR、瘦素、sOB-R及FLI均高于野生型，除瘦素及sOB-R外均有顯著差異(P< 0.05)。結論PCR-HRM能準確及高通量地實現對瘦素基因啟動子多態性進行分析，并驗證了A位點基因頻率的增高可能和肝硬化發生有關；肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗，瘦素可能與肝硬化患者胰島素抵抗發生有關。

高分辨率熔解曲線分析； 瘦素; 基因啟動子； 基因多態性； 肝硬化

瘦素(leptin，Lp)是一種由脂肪組織分泌的激素，參與脂肪及能量代謝，進而調節體重。該編碼基因由于其啟動子區在C2549和C2548位點存在多態性，這些位點突變往往和瘦素調控的相關疾病發生有關[1-2]，但往往由于篩查方法采用PCR-限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技術，很難進行高通量的相關性統計分析，難以得到較為準確的結論。本研究試圖通過PCR-高分辨率熔解曲線分析(high-resolution mel-ting curve analysis)，同時結合生理生化指標的檢測分析，以期篩選出與肝硬化發生相關的瘦素基因啟動子多態性位點，同時通過該方法得出基因型個體與瘦素相關指標之間的關系。

材 料 和 方 法

1研究對象

收集從2010年3月至2011年9月來我院就診的乙肝后肝硬化患者100例(肝硬化組)，男性61例，女性39例，年齡37～75歲，平均年齡(54.12±10.13 )歲，均符合2000年9月西安中華醫學會傳染病與寄生蟲學分會、肝病學分會聯合修訂肝硬化診斷標準。血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)均陽性，并排除糖尿病、腎病、心臟病、腫瘤、艾滋病、梅毒及合并嚴重感染影響激素代謝的疾病。對照組100例，男性69例，女性31例，年齡35～74歲，平均年齡(55.20±8.75)歲，為我院同期健康體檢者，均排除各種病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝的健康人群。2組間在性別、年齡和體重指數上相比較無統計學意義，見表1。以上研究對象均為漢族，彼此間無血緣關系。本研究方案由浙江中醫藥大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審批通過，受檢者均知情同意。

2方法

2.1生理生化指標測定 隔夜空腹8 h以上抽取肘靜脈血，檢測空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和空腹胰島素(fasting insulin,FINS)。同時取靜脈血2 mL，離心后取上清，放置于-80 ℃冰箱里保存，待測血清Lp、可溶性瘦素受體(soluble leptin receptor,sOB-R)。FPG及FINS檢測均采用雅培貿易(上海)有限公司提供檢測試劑盒檢測；其中，FPG采用己糖激酶法檢測，FINS采用化學發光微粒子免疫檢測法檢測；Lp檢測采用上海研生生化試劑有限公司提供的人瘦素ELISA檢測試劑盒檢測；sOB-R檢測采用上海優研生化試劑有限公司提供的人可溶性瘦素受體ELISA檢測試劑盒檢測。測體重及身高，體重指數(body mass index,BMI)=體重(kg)/[身高(m)]2，胰島素抵抗指數(insulin resistance index was estimated by homeostatic model assessment,HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5，胰島素敏感指數(insulin sensitivity index,ISI)=1/ FPG×FINS，游離瘦素指數(free leptin index,FLI)=Lp/sOB-R。

2.2血液基因組DNA提取 晨抽取空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，采用血液基因組DNA提取試劑盒(杭州浩基生物科技有限公司)進行提取，溶解于10 mmol/L Tris(pH 8.0)中，紫外分光光度計和電泳分析DNA的含量及完整性。

2.3PCR-HRM擴增分析 根據人瘦素基因啟動子序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計PCR-HRM引物，其正反向序列分別是5'-GGCTTTCTAAGCCAAGGCAAAA-3'和5'-GCAACATCTCAGCACTTAGGGAG-3'，擴增長度為222 bp。PCR采用2×SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)，反應體系：2×SsoFast EvaGreen Supermix 10 μL，10 μmol/L正向和反向引物 1 μL，50 ng模板基因組DNA，加入去離子水定容到20 μL。反應條件：98 ℃，變性30 s，98 ℃ 5 s、60 ℃ 退火/延伸10 s(收集熒光信號)，循環40次，隨后98 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，在70 ℃～90 ℃之間，每隔10 s上升0.2 ℃，進行熔點曲線的制作。該擴增采用CFX96 PCR擴增儀(Bio-Rad)完成，隨后采用Precision Melt軟件進行校正標準曲線的制作；PCR產物送往上海英濰捷基生物技術有限公司進行測序鑒定。

2.4PCR-RFLP方法 傳統方法采用PCR-RFLP技術擴增基因組DNA片段并進行基因分型，其正向和反向序列分別為：5'-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3' 和5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，具體擴增條件和體系參照文獻[3]。PCR擴增采用2×PCR Master Mix(杭州浩基生物科技有限公司)，簡單如下：2×PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L正向引物和10 μmol/L反向引物分別是0.5 μL，50 ng基因組DNA，最后加入去離子水定容到25 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環35次。242 bp PCR產物經CfoI(HhaI)(Roche)37 ℃消化2 h，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析及基因分型。當基因型為AA時，2個等位基因均有切點，酶切后有181 bp和61 bp 2條帶；CC基因型時，2個等位基因均無切點，酶切后為242 bp 1條帶；AC基因型時，一個等位基因有切點，另一個等位基因無切點，酶切后為242 bp、181 bp和61 bp 3條帶。

3統計學處理

結 果

1肝硬化組和正常組生理生化指標

肝硬化組總Lp、經BMI調整后Lp、FLI、FINS及HOMI-IR高于對照組，ISI及sOB-R低于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)。FLI與FINS及HOMI-IR呈正相關(r=0.45,r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負相關(r=-0.34,P<0.05)，說明肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗；Lp生物學活性與肝硬化患者胰島素抵抗發生有關。

按性別分類，無論是肝硬化組還是正常組，女性Lp、sOB-R及FLI均高于男性，差異有統計學意義(P<0.01)。但男性肝硬化患者Lp水平同男性對照組相比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2血液基因組DNA提取結果

本實驗提取的血液基因組DNA，A260/280比值均在1.6～1.8之間，濃度為50～100 mg/L，1%瓊脂糖凝膠電泳分析表明提取的DNA是完整的，隨機選擇基因組DNA電泳結果見圖1。

表1對照組和肝硬化組生理生化指標比較

IndexCirrhosisControlSex(male/female)61/3969/31Age(year)54.12±10.1355.20±8.75BMI(kg/m2)22.52±3.2023.07±7.13FPG(mmol/L)5.67±1.645.21±1.07FINS(U/L)14.11±7.92**5.63±3.42HOMA-IR3.55±1.36**1.30±0.52ISI0.01±0.01**0.03±0.02LP(ng/L)16.92±9.03**11.76±8.41 Male10.72±8.68(n=61)8.63±7.21(n=69) Female26.64±7.38**△△(n=39)18.73±9.22△△(n=31)Lp/BMI(ng·L-1·kg-1·m2)0.73±0.42**0.51±0.33sOB-R(ng/L)5.63±2.13**8.18±3.22 Male4.36±2.21**(n=61)6.39±3.72(n=69) Female7.91±3.50**△△(n=39)12.09±4.77△△(n=31)FLI3.01±2.78**1.44±0.98 Male2.46±0.72**(n=61)1.35±0.88(n=69) Female3.37±1.29**△△(n=39)1.55±0.88△△(n=31)

BMI: body mass index; FPG: fasting plasma glucose; FINS: fasting insulin; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index；Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptor; FLI: free leptin index.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmale in the same group.

Figure 1. Electrophoresis analysis of genomic DNA isolated from blood in control and liver cirrhosis patients.M:DNA marker.

圖1正常組和肝硬化組隨機血液樣品基因組DNA電泳結果

3PCR-HRM3種基因型的擴增結果

通過對收集樣品瘦素基因啟動子序列進行PCR-HRM擴增，然后采用Precision Melt軟件(Bio-Rad)進行標準化熔解曲線(normalized melting curve)和差異曲線(difference curve)分析，能夠很明顯地分為3種類型，然后對這3種類型PCR產物進行測序鑒定，結果發現CC野生型、AA純合型和CA雜合型3種基因型，見圖2。對這3種基因型擴增產物進行了測序分析，發現這一突變發生在2 549位上，而不是發生在2 548位上，這表明2 549位的堿基突變與肝纖維化的發生發展存在相關性。

4PCR-RFLP3種基因型的分析結果

對PCR-HRM擴增結果得到的3種基因型，通過PCR-RFLP方法進行分析鑒定，結果表明PCR-HRM方法鑒定得到的CC野生型，采用PCR-RFLP酶切后出現了242 bp的條帶，AA純合型出現了181 bp和61 bp 2條帶，CA雜合型出現了242 bp、181 bp和61 bp 3條帶,見圖3。

Figure 2. Curves and sequencing results of PCR-HRM products from the three genotypes.A: normalized melting curves of PCR-HRM amplification; B: difference curves of PCR-HRM amplification；C: sequencing results of PCR-HRM products.

圖23種基因型PCR-HRM擴增結果

Figure 3. Electrophoresis analysis of PCR-RFLP in the three genotypes.M:DNA marker.

圖33種基因型PCR-RFLP產物電泳分析結果

5PCR-RFLP和PCR-HRM2種方法分析樣品瘦素基因啟動子基因型

通過對100例正常組和100例肝硬化組樣品，分別采用PCR-RFLP和PCR-HRM 2種方法對瘦素基因啟動子基因進行分型，3種基因型的分析鑒定結果無顯著差異(P>0.05)，該結果表明2種基因分析方法對瘦素基因啟動子多態性C2549檢測具有較好的一致性，說明采用PCR-HRM方法能夠準確、高通量實現對肝纖維化中2 549位點突變的檢測和分析。分析結果表明：肝硬化組A堿基突變頻率明顯高于對照組(P< 0.05)，并以C2549雜合型個體占優勢(P<0.05)，見表2。

6肝硬化組基因型與生理生化指標的關系

肝硬化組純合和雜合型突變個體的HOMI-IR、Lp、sOB-R及FLI指標值均高于野生型，除Lp及sOB-R外，其余指標值均有顯著差異(P< 0.05)，見表3。這表明C2549A突變可能與肝硬化的發生發展有關。

表2 PCR-RFLP和PCR-HRM瘦素基因啟動子C2549位點基因檢測結果比較

△P<0.05vsnormal.

表3 肝硬化組不同基因型生理生化指標比較

BMI: body mass index; HOMA-IR: insulin resistance index; ISI: insulin sensitivity index; Lp: leptin; sOB-R: soluble leptin receptors; FLI: free leptin index.△P<0.05vswildtype(CC).

討 論

Lp是作為脂肪細胞分泌的一種激素，能夠廣泛參與脂肪代謝和能量代謝，該基因位于染色體7q31.3，為單拷貝基因。該基因啟動子區存在C2549和G2548兩個可能的突變位點，本研究初步發現C2549A突變和肝硬化的發生發展有關，這和國內外的研究相一致[4-5]。

和傳統PCR-RFLP技術相比，新穎的PCR-HRM技術是一種新型的突變篩選和分析技術，該技術能夠通過擴增產物Tm值0.2 ℃的差別很容易鑒定出野生型和突變個體，利用該技術實現了腫瘤發生相關突變、微生物突變等的快速檢測和分析，而且該技術快捷、高通量以及靈敏度較高等優點成為未來基因突變檢測分析的重要手段之一[6-7]。本研究中采用PCR-HRM技術，同時對比PCR-RFLP方法，表明該方法能夠實現對瘦素基因啟動子C2549A突變進行準確、高通量分析，同時簡易的操作方法便于基層醫療檢測部門進行C2549A分型與肝硬化易感預測分析。

在肝硬化組中，Lp水平高于對照組，但無顯著差異；與文獻報道一致[8]。而男女個體中，女性Lp水平明顯高于男性，這一現象可能與雌激素影響細胞因子的釋放有關[9]。sOB-R是主要的Lp結合蛋白，Lp在體內生物學活性與體內總Lp無關，FLI是代表Lp在體內生物學活性的指標[10-11]，本研究中，sOB-R水平在肝硬化組患者中明顯減少，FLI明顯高于對照組，FLI與FINS及HOMI-IR呈正相關(r=0.45，r=0.53,均P<0.05)，與ISI呈負相關(r=-0.34,P<0.05)，說明肝硬化患者存在高胰島素血癥及胰島素抵抗；Lp生物學活性與肝硬化患者胰島素抵抗發生有關。

肝硬化患者中，C2549A純合突變型和雜合突變型FLI及HOMI-IR高于野生型，C2549A雜合突變的基因頻率明顯高于野生型(P< 0.05)，這一結果推測由于C2549突變導致基因啟動子雙鏈結構不穩定，尤其C2549雜合突變，利于與Lp相關轉錄激活因子的結合，導致Lp蛋白的大量表達；該蛋白進而通過和其受體的結合，激活下游JAK/STAT和TGF-β/Smads等信號通路，最終促使肝纖維化、肝硬化的發生發展。因此，收集更多不同省份、不同人種的肝硬化患者血清樣品，采用PCR-HRM方法進一步進行C2549A位點突變與肝硬化發生發展的相關性分析，為從瘦素啟動子突變來研究肝硬化的發病機制提供更多的理論依據。

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ApplicationofPCR-HRMinthestudyofrelationshipbetweenleptingenepromoterpolymorphismsandlivercirrhosis

LI Shan-gao1, CAO Hai-jun1, LIU Jun2, XU Guo-ping1, SUN Ming-hong3, ZHU Xiao-hong4, Lü Bin1, MENG Li-na1

(1DepartmentofGastrointestinalMedicine,3DepartmentofLaboratoryMedicine,4DepartmentofHepatopathy,TheFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;2CollegeofLifeSciences,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China.E-mail:galisga@yahoo.com.cn)

AIM: To analyze the feasibility of PCR-high-resolution melting curve analysis (HRM) for detecting the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter from the patients with liver cirrhosis, and to explore the relevance between mutant genotypes and physiological and biochemical indexes in liver cirrhosis patients.METHODSCompared with the method of PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP), the present research used the method of PCR-HRM to analyze the site mutations of C2549 and G2548 in leptin gene promoter in control group (n=100) and liver cirrhosis group (n=100). The physiological and biochemical indexes of the patients were also detected and compared.RESULTSLeptin gene promoter polymorphism was detected using PCR-HRM with effectiveness, high flux and accuracy. Preliminary results showed that the main mutation of the patients with liver cirrhosis was in C2549 site, but not found in G2548 site. Leptin, free leptin index (FLI), fasting insulin (FINS) and insulin resistance index estimated by homeostatic model assessment (HOMA-IR) in liver cirrhosis group were higher than those in control group. Insulin sensitivity index (ISI) and soluble leptin receptor (sOB-R) in liver cirrhosis group were lower than those in control group with significant difference except leptin level. Meanwhile, FLI showed positively correlated with FINS and HOMA-IR (r=0.45,r=0.53,P<0.05), and negatively with ISI (r=-0.34,P<0.05). In the patients with liver cirrhosis, C2549A heterozygous mutation was predominant. The indexes of HOMI-IR, leptin, sOB-R and FLI of C2549A homozygotes and heterozygotes were higher than those of the wildtypes, which showed significant difference except leptin and sOB-R levels (P<0.05).CONCLUSIONPCR-HRM can be more accurate for identifying leptin promoter polymorphism. The increase in the frequency of C2549A mutation may be closely related with liver cirrhosis. Existence of hyperinsulinemia and insulin resistance may be correlated with leptin level in the patients with liver cirrhosis.

High-resolution melting curve analysis; Leptin; Promoter,genetic; Polymorphism,genetic; Liver cirrhosis

R446.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.029