核黃素預處理減輕大鼠肝缺血再灌注損傷*

李 偉， 陸曉華， 趙 雪， 王國光

(皖南醫學院基礎部病理生理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

1000-4718(2012)07-1314-05

2012-01-04

2012-05-11

皖南醫學院中青年科研基金資助項目(No. WK200827)

△通訊作者 Tel: 0553-3932476；E-mail: guoguangw1226@sina.com

核黃素預處理減輕大鼠肝缺血再灌注損傷*

李 偉， 陸曉華， 趙 雪， 王國光△

(皖南醫學院基礎部病理生理學教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的探討核黃素對肝缺血再灌注損傷的影響及其機制。方法將24只SD大鼠隨機分為3組，每組8只。假手術對照組(sham組)和缺血再灌注組(I/R組)大鼠喂以正常飼料，核黃素預處理組(R+I/R組)大鼠補充核黃素。喂養4周后，阻斷大鼠肝門1 h，再灌注1 h建立I/R模型。術后采血并收集肝臟標本，分別檢測血清及肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平和血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的活性；蛋白印跡法檢測肝組織血紅素加氧酶-1(HO-1) 表達情況；HE染色觀察肝組織病理學改變。結果與sham組比較，I/R組大鼠血清AST、ALT活性及MDA水平均明顯升高，SOD活性顯著降低(P<0.01)；肝組織中SOD活性亦明顯下降(P<0.01)，MDA水平及HO-1蛋白表達則顯著增高(P<0.05)。而R+I/R組較I/R組大鼠血清AST、ALT活性及MDA水平均明顯下降，SOD活性顯著增強(P<0.01)；肝組織中MDA水平亦明顯降低，SOD及HO-1蛋白表達顯著增高(P<0.01)。組織切片顯示I/R組大鼠肝細胞腫脹，炎癥細胞浸潤，小葉結構紊亂；R+I/R組大鼠肝細胞僅輕度腫脹，幾乎無氣球樣變，小葉結構清晰。結論核黃素預處理對缺血再灌注肝臟具有顯著的保護作用，其作用機制可能與核黃素通過降低MDA水平、提高SOD活性及HO-1蛋白表達，增強肝臟的抗氧化能力，減輕脂質過氧化反應有關。

核黃素; 肝臟; 缺血再灌注; 血紅素加氧酶-1

缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是導致肝臟移植和肝臟切除術后肝功能障礙及衰竭的重要原因，許多因素和調節介質在肝缺血再灌注損傷中發揮重要作用[1-2]。肝組織缺血再灌注引起氧自由基生成增多，從而導致肝細胞膜、線粒體膜、微粒體膜以及溶酶體膜發生脂質過氧化，最終導致肝損傷，是肝缺血再灌注損傷重要機制之一[3]。

核黃素(riboflavin)在體內以黃素腺嘌呤單核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)的形式存在，是生物體內黃素酶的輔酶。作為一種天然的抗氧化劑，核黃素具有可逆的氧化還原特性，能通過氧化還原反應清除自由基[4-5]。缺血再灌注損傷的發生、發展是一個連續的過程，是許多相關因子聯合作用的結果，其中氧自由基產生的脂質過氧化物可以通過氧化漿膜，使膜的流動性和通透性發生改變，也可通過氧化核酸使DNA雙鏈斷裂直接損傷細胞。目前，用藥物預處理法替代缺血誘導對肝臟的保護作用安全閾大，無需其它特殊儀器設備，便于臨床推廣和應用[6]。因此，尋找肝缺血再灌注損傷的保護藥物便成為肝臟外科研究的熱點。本研究通過核黃素預處理大鼠，觀察其對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用，為其在肝臟外科領域的研究與應用提供理論依據。

材 料 和 方 法

1動物

正常健康SD大鼠24只，雌雄不拘，體重268～312 g，購于南京青龍山動物養殖場。

2主要試劑

核黃素購于上海化學試劑采購供應站；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。DAB顯色購于Bio Basic Inc.；血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)兔抗鼠多克隆抗體購于武漢博士德公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購于Sigma。

3動物分組及模型的制備

24只健康SD大鼠隨機分為3組：假手術對照組(sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、核黃素處理組(R+I/R組)，每組8只，自由進食飲水。Sham組和I/R組大鼠每天喂以正常飼料，R+I/R組大鼠輔以核黃素喂養(40 mg·kg-1·d-1)。喂養4周后，手術前禁食12 h，自由飲水，用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)經腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，腹部皮膚消毒，自劍突開始沿腹白線開腹，游離肝周韌帶暴露肝門。Sham組關閉腹腔，I/R組和R+I/R組用無創血管夾阻斷肝動脈、門靜脈及膽總管，令肝臟進入缺血狀態，關閉腹腔。缺血1 h后開腹，松開血管夾恢復血液灌注。肝臟由暗紅變為鮮紅，即建成肝缺血再灌注損傷動物模型，關閉腹腔。灌注1 h后開腹，各組大鼠均于下腔靜脈取血4 mL，1 000×g離心20 min分離血清。同時處死動物，取肝臟一部分置于10%中性甲醛溶液固定；一部分置于-70 ℃冰箱冷凍保存。

4生化指標分析

以全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)；黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD活性；硫代巴比妥酸比色法檢測血清MDA含量，嚴格按照試劑盒說明操作。取冷凍的肝臟組織勻漿并離心分離，取上清測定SOD活性及MDA水平。

5HO-1活性檢測

采用Schmidt等[7]的方法進行：取肝組織置于預冷的磷酸鉀緩沖液(含2 mmol/L MgCl2和0.1 mmol/L PMSF，pH 7.4) 中勻漿，然后于4 ℃、12 000×g離心20 min。反應總體積1 mL，含大鼠肝組織勻漿液600 μL、氧化型輔酶II 0.8 mmol/L、6- 磷酸葡萄糖1 mmol/L、6-磷酸葡萄糖脫氫酶0.2 U和2.5 mmol/L 氯化高鐵血紅素10 μL，混勻后，37 ℃振蕩水浴避光反應1 h，加0.5 mL 氯仿充分混合終止反應。在464 nm 和530 nm 雙波長下檢測氯仿層吸光度值，并計算出反應生成的膽紅素量。以生成的膽紅素量表示HO-1 活性，單位為μmol·h-1·(g protein)-1。

6蛋白印跡分析

取0.2 g肝組織用預冷的PBS洗去血跡，放入勻漿器，加2 mL預冷的組織裂解液及20 μL 0.2 mol/L PSMF異丙醇溶液，勻漿后移至EP管。4 ℃、12 000×g離心20 min，上清液用Bradford法測定蛋白含量。取含同等蛋白量的樣本稀釋至等體積，每孔上樣20 μL，SDS-PAGE電泳分離，用0.22 μm硝酸纖維素膜進行冰浴轉膜，結束后取出膜用5%脫脂奶粉TBS-T液于搖床上室溫封閉2 h。4 ℃加兔抗鼠HO-1多克隆抗體(1∶500)雜交過夜，TBS-T沖洗，加Ⅱ抗(1∶5 000)室溫雜交2 h，洗膜后，DAB顯色。以β-actin作為內參照，結果以目的條帶和內參比值表示。Quantity One軟件分析結果(Bio-Rad)。

7組織病理學分析

取甲醛固定的肝組織石蠟包埋后，切片，蘇木素-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察。

8統計學處理

結 果

1核黃素對生化指標的影響

I/R組大鼠與sham組比較，血清AST和ALT活性、MDA水平明顯升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；R+I/R組大鼠在缺血再灌注后血清AST和ALT活性、MDA水平較I/R組降低(P<0.01)，SOD活性相應升高(P<0.01)，見表1。

2肝組織SOD活性及MDA含量

I/R組大鼠肝組織SOD活性明顯低于sham組(P<0.01)，而R+I/R組SOD活性較I/R組則明顯升高(P<0.01)；I/R組大鼠肝組織MDA水平明顯高于sham組，而R+I/R組則較I/R組明顯降低(P<0.01)，見圖1。

表1 各組大鼠血清生化學指標的比較

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.

圖1各組大鼠肝組織SOD活性、MDA水平比較

3肝組織HO-1活性

I/R組HO-1酶活性較sham組有所升高(P<0.05)；而與I/R組比，R+I/R組核黃素預處理能導致缺血肝組織HO-1酶活性明顯上調(P<0.01)，見圖2。

圖2各組大鼠肝組織HO-1活性的比較

4蛋白印跡檢測肝組織HO-1蛋白表達

蛋白印跡顯示R+I/R組可見HO-1蛋白表達信號較強，HO-1/β-actin值均明顯高于sham組和I/R組(P<0.01)。I/R組HO-1蛋白表達亦強于sham組(P<0.01)，見圖3。

5肝組織病理學分析

光鏡下sham組肝細胞形態正常，小葉結構正常，無明顯炎癥細胞浸潤。I/R組肝細胞有細胞腫脹，炎癥細胞浸潤、小葉結構紊亂；R+I/R組肝細胞亦有輕度細胞腫脹，而幾乎無氣球樣變，小葉結構尚清晰，見圖4。

討 論

缺血再灌注損傷是組織在缺血基礎上恢復血流后組織損傷反而加重，甚至發生不可逆損傷的1種病理過程。肝缺血再灌注損傷是肝移植、肝切除術及嚴重肝臟創傷手術等常涉及的共同病理生理變化，其發生機制復雜。大量研究證實，其發生與鈣超載、氧自由基損傷、線粒體功能異常、能量物質耗竭等因素相關[8]。在缺血期，白細胞及血小板黏附于內皮細胞導致血管損傷；再灌注使肝竇內皮細胞(sinusoidal endothelial cell，SEC)凋亡，一氧化氮和氧自由基生成增多，激活Kupffer細胞而釋放超氧自由基、TNF-α等，進一步加劇氧化損傷[9-10]。氧化與抗氧化的平衡一直是缺血再灌注損傷機制研究的熱點。有研究指出活性氧(reactive oxidative species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)在肝臟缺血再灌注損傷中起非常重要的作用。在正常情況下抗氧化系統能夠控制ROS和RNS的產生，當氧化應激發生時，ROS和RNS的產生與清除之間的平衡被打破，導致抗氧化系統的衰竭或者氧化物大量產生。此外，還有一些重要保護物質越來越受到大家的重視，如熱休克蛋白(heat-shock protein，HSP)的表達、一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)的釋放、HO-1活性的增加等[6]。

圖3蛋白印跡法檢測各組大鼠肝組織HO-1蛋白的表達情況

Figure 4. Hepatic pathology of rats in different groups(HE staining,×400).A: sham group; B: I/R group; C: R+I/R group.

圖4各組大鼠肝組織病理結構特點

AST和ALT水平是評價肝功能的常用指標。SOD是細胞內主要的內源性抗氧化酶和氧自由基清除劑，其活性變化可以反映體內的抗氧化能力，MDA是體內最重要的膜脂質過氧化的代謝產物，是衡量組織過氧化損傷程度的指標，可以間接反映細胞損害程度。本實驗結果顯示， I/R組大鼠血清和肝組織SOD活性顯著減弱，同時伴隨MDA水平升高，血清AST和ALT升高，提示缺血再灌注后，肝細胞受損，肝功能降低，氧自由基清除能力下降。R+I/R組，再灌注后，血清AST和ALT水平下降，血清和肝組織SOD活性顯著升高，MDA水平下降，肝細胞形態學異常改變也較再灌注組明顯減輕，提示核黃素預處理可能通過加強大鼠體內抗氧化系統的作用，提高氧自由基清除劑的水平與活力，減輕氧自由基介導的脂質過氧化反應對肝臟的損傷，加速自由基的清除，從而達到對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。

HO-1是血紅素降解的起始酶和限速酶，其不僅直接降解血紅素，同時還消耗氧和電子，而且能夠通過血紅素的催化產物，如：CO、膽綠素/膽紅素和游離鐵等，發揮其細胞保護功能[11]。HO-1是誘導型蛋白，分子量為33 kD， 亦稱為熱休克蛋白32(HSP32)。它廣泛分布于全身組織，以肝、脾內含量最高，在肝臟中HO-1主要以Kupffer細胞所表達。生理情況下，HO-1在組織中呈低水平表達，但熱休克、血紅素、內毒素、氧化應激等多種因素均可誘導其高表達[12-13]。此外，抗氧化劑亦可通過激活Nrf2途徑誘導Kupffer細胞表達HO-1[14]。本研究結果顯示，sham組大鼠肝臟檢測到HO-l表達較低，I/R組肝組織HO-1表達增強，表明缺血再灌時肝組織損傷加重，可產生氧化應激并誘導HO-1表達。R+I/R組大鼠肝組織HO-1表達較I/R組明顯增強，提示核黃素可能通過激活Nrf2途徑誘導Kupffer細胞高表達HO-1，從而抑制kuffer細胞的釋放反應，減輕細胞因子、趨化因子、炎癥介質、活性氧等介導的肝臟缺血再灌住損傷。關于其保護作用的詳細機制尚需進一步研究。

綜上所述，核黃素可能通過減少氧自由基生成，增強機體抗氧化作用及HO-1的高表達來實現對缺血再灌注肝臟的保護作用。因此，核黃素預處理對肝缺血再灌注損傷的防治可能具有潛在的臨床價值。

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Riboflavinpreconditioningalleviateshepaticischemia/reperfusioninjuryinrats

LI Wei, LU Xiao-hua, ZHAO Xue, WANG Guo-guang

(DepartmentofPathophysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:guoguangw1226@sina.com)

AIM: To explore the protective effect of riboflavin preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in rats.METHODSTwenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups (n=8): sham group, ischemia/reperfusion (I/R) group and riboflavin preconditioning (R+I/R) group. The rats in sham group and I/R group

a standard chow,while the rats in R+I/R group received a chow supplemented with riboflavin. After 4 weeks, portal vein and hepatic artery supplying the middle and left hepatic lobes were clamped with a traumatic vascular clip for induction of partial hepatic ischemia in the rats in I/R group and R+I/R group. After 1 h of ischemia, 1 h of reperfusion was conducted by removal of the clip. The activity of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum,the activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) in serum and liver were measured. Western blotting was employed to examine the protein expression of heme oxygenase-1(HO-1) in the liver.RESULTSThe results showed that ischemia/reperfusion injury markedly increased the activity of AST and ALT in serum, decreased the activity of SOD, and elevated the level of MDA and the activity of HO-1 in the liver as compared with sham group (P<0.01). The riboflavin pretreatment significantly decreased the activity of AST and ALT in serum, increased the activity of SOD and decreased the levels of MDA in serum and liver as compared with I/R group (P<0.01). In addition, the protein expression of HO-1 and the activity of HO-1 were elevated in R+I/R group (P<0.01). Cytoplasmic vacuolation and swelling of the hepatocytes were observed in I/R group. Treatment with riboflavin markedly alleviated the changes of liver structure.CONCLUSIONRiboflavin preconditioning has protective effect on hepatic ischemia/reperfusion injury. The mechanism may be correlated with enhancing the anti-oxidation and alleviating the reaction of lipid peroxidation．

Riboflavin; Liver; Ischemia reperfusion; Heme oxygenase-1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.030