運動訓練對老齡大鼠心肌多胺代謝的影響*

王偉偉， 薛 過， 張 昊， 張偉華， 王麗娜， 李紅霞， 林 巖， 徐長慶， 趙雅君△

(1哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150086； 2齊齊哈爾醫學院病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

1000-4718(2012)09-1543-06

2012-03-19

2012-06-25

國家自然科學基金資助項目 (No.81170178)

△通訊作者Tel：0451-86674548; E-mail: zhaoyajun1964@163.com

運動訓練對老齡大鼠心肌多胺代謝的影響*

王偉偉1， 薛 過1， 張 昊1， 張偉華1， 王麗娜1， 李紅霞1， 林 巖2， 徐長慶1， 趙雅君1△

(1哈爾濱醫科大學病理生理教研室，黑龍江 哈爾濱 150086；2齊齊哈爾醫學院病理生理教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的通過觀察運動訓練對老齡大鼠心肌多胺代謝、心肌抗炎及抗氧化能力的影響,探討多胺代謝在運動訓練延緩心肌衰老中的作用。方法實驗分為3組：老年運動組(Old+Ex)，18月齡Wistar大鼠梯度跑臺運動6周；老年組(Old)，與Old+Ex組月齡相同的Wistar大鼠；青年組(Young)，3月齡Wistar大鼠。高效液相色譜測定心肌組織中多胺(腐胺、精脒和精胺)含量；[14C]標記液閃計數方法測定心肌組織中多胺合成限速酶鳥氨酸脫羧酶 (ODC) 與多胺分解限速酶精脒/精胺乙酰轉移酶 (SSAT) 活性；比色法檢測心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測心肌組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)含量；超聲心動圖記錄大鼠心臟功能；透射電鏡觀察心肌組織超微結構變化。結果與Young組比，Old組大鼠心肌組織中ODC活性下降, SSAT活性升高, 精脒、精胺及總多胺池水平顯著降低；心肌SOD活性下降，MDA、TNF-α和IL-1β水平升高(P<0.05)；超聲心動圖顯示，Old組大鼠左心室收縮末期直徑(LVESD)與舒張末期直徑(LVEDD)均明顯增大，左心室射血分數(LVEF)與縮短分數(LVFS)降低(與Young組比，P<0.01)。Old+Ex組大鼠心肌組織中ODC活性增加，SSAT活性下降，精脒及總多胺池水平明顯增加；心肌SOD活性升高，MDA、TNF-α和IL-1β水平均顯著降低(與Old組比，P<0.05)；左室功能有明顯改善。超微結構觀察可見Old組心肌肌絲排列不整齊，可見大量脂褐素顆粒沉積，線粒體基質疏松；Old+Ex組心肌肌節結構清晰，線粒體基質致密，嵴排列整齊。結論運動訓練通過上調多胺合成代謝、抑制其分解代謝對抗衰老引起的心肌多胺水平降低；運動訓練可提高老齡心肌抗炎、抗氧化能力。維持老齡心肌多胺池在適當水平可能是運動延緩心肌衰老的部分機制之一。

運動； 多胺； 心臟； 脂質過氧化； 炎癥介質； 老化; 大鼠

多胺 (polyamines, PAs) 包括精脒 (spermidine, Spd)、精胺 (spermine, Sp) 及其前體腐胺 (putrescine, Pu),是一組非蛋白質含氮小分子化合物，廣泛存在于生物體內，與生物大分子結合，在細胞的生長、分化、增殖與凋亡中發揮重要作用。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC) 為多胺合成代謝的限速酶，精脒/精胺乙酰轉移酶 (spermidine/spermineN1-acetyltransferase, SSAT)為多胺逆轉化分解代謝的限速酶[1]。研究顯示,增殖旺盛的組織細胞ODC活性增加,多胺水平增加，隨老化的發展，組織器官多胺水平降低，ODC活性也呈相同下降趨勢[2]；外源性多胺能夠延長生物體的壽命[3]。我們前期的研究也證實外源性多胺可通過清除自由基、抑制炎癥介質產生在一定程度上延緩大鼠衰老[4]。適度運動訓練(exercise training, Ex)能夠增加心肌的抗氧化能力、增加心肌對細胞內鈣變化的適應性、促進心鈉素的合成與分泌、增加心肌糖原儲備，改善老年人的心臟功能和代謝[5]。潘燕等[6]也報道Ex可通過降低血液中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平及中樞AngⅡ1型受體(AT1R)的表達增強慢性心衰大鼠動脈壓力反射功能。但Ex是否對老齡大鼠心肌的多胺代謝有影響，還不清楚。本實驗通過觀察梯度Ex對老齡大鼠心肌多胺代謝、心肌抗炎及抗氧化能力的影響,初步探討多胺代謝在運動抗心肌衰老中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 腐胺、精脒和精胺均購自Sigma；DL-[1-14C] ornithine HCl和[1-14C]acetyl-CoA購自Amersham；SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號為970912和20041020)。大鼠IL-1β和TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒購自中杉生物技術公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；氯仿(國產，色譜純)；苯甲酰氯及其它試劑(國產，分析純)。

1.2主要儀器 FT-200動物跑步機(成都泰盟科技有限公司)；Waters高效液相色譜儀、600 Controler和2487紫外檢測器(Waters)； Hypersil ODS C18柱(250 mm × 416 mm, 5 μm) (大連伊利特分析儀器有限公司)；LS-6500型液閃計數儀(Beckman)；US-640型紫外分光光度計(Beckman)；Model 550酶標儀(Bio-Rad)；低溫離心機(Beckman)；恒溫水浴鍋(成都泰盟科技有限公司)。

2方法

2.1實驗分組 雄性 Wistar大鼠，清潔級,由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。實驗分3組，老年運動組(old & exercise，Old+Ex,n=7)：18月齡大鼠，梯度跑臺運動6周。跑臺速度為20 m/min,以20 min/d開始運動,每3 d運動時間增加5 min，直至60 min/d時，運動時間不再變化。老年組(Old,n=8)：與老年運動組月齡相當、自由飲水進食的老齡大鼠。青年組(Young,n=8)：體重(280±20)g,自由飲水進食的3月齡大鼠。

2.2大鼠心臟多胺含量檢測 各組動物均給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔取出心臟,在冷的生理鹽水中漂洗、拭干。取左心室約150 mg，加入0.3 mmol/L冷的高氯酸在冰水浴中制成勻漿，3 500 r/min離心10 min，上清貯存在-80 ℃直至分析使用。取制備好的組織勻漿，取上清加入1, 6-己二胺(內標)、NaOH和苯甲酰氯，混勻, 40 ℃水浴30 min。加氯仿2 mL,漩渦振蕩,離心。取氯仿層,加入流動相,漩渦振蕩,離心。提取氯仿層,通風櫥中加熱揮干,殘余物溶于甲醇中,取20 μL上高效液相色譜柱應用高效液相色譜分析儀檢測各組中多胺含量。色譜條件: Hypersil ODS C18柱(250 mm×416 mm, 5 μm),流動相為甲醇與水(V∶V=65∶35),柱溫25 ℃, 流速為0.6 mL/min, 紫外檢測波長為229 nm[1]。

2.3心肌組織ODC活性測定 用放射計數分析計算從DL-[1-14C] ornithine HCl 釋放出的[14CO2] 的量, 代表ODC活性。實驗在橡膠塞封閉的5 mL玻璃試管中進行, 橡膠塞上插有注射器針頭, 針頭上帶一片直徑為8 mm玻璃纖維素膜, 纖維素膜事先用50 μL 2 mol/L NaOH濕潤，取備用上清90 μL加入[14C] 標記的DL-[1-14C] ornithine HCl 反應總體積為100 μL。 蓋緊橡膠塞, 37 ℃孵育60 min, 加入40% 檸檬酸終止反應, 37 ℃繼續孵育30 min。取出吸附[14CO2] 的玻璃纖維素膜, 將其置于裝有5‰ PPO 5 mL的液閃杯中, 20 min后上機計數放射活度。ODC 的活性以釋放出的μmol[14CO2] ·(g protein)-1·h-1來表示[7]。

2.4SSAT活性測定 放射計數分析計算從[1-14C] acetyl-CoA 生成的[14C] acetyl Spd 的量, 代表SSAT的活性。實驗在5 mL玻璃試管內進行。取備用上清86 μL, 分別加入spermidine(3 mmol·L-1)、[1-14C]acetyl- CoA 及Tris-HCl 使反應總體積為100 μL。用插有注射器針頭的橡膠塞蓋緊試管,37 ℃孵育10 min, 加入20 μL 1 mmol·L-1冷鹽酸羥胺終止反應, 沸水中煮沸3 min, 22 000×g離心5 min, 取50 μL上清噴灑在直徑為20 mm的Whatman P81的硫酸纖維素膜上,70 ℃ 烤箱烤干, 蒸餾水沖洗5次, 無水乙醇沖洗3次, 室溫干燥1 h。將硫酸纖維素膜置于裝有5‰ PPO 5 mL的液閃杯中, 20 min后上機計數放射活度。SSAT 活性以生成μmol[14C]acetyl Spd· (g protein)-1·min-1表示[7]。

2.5超聲心動圖測定大鼠心臟功能 大鼠麻醉后胸部備皮, 仰臥位固定, 用14.0 MHz探頭連接超聲檢查儀,對大鼠進行超聲檢查。探頭置于其左胸,在取得滿意的胸骨旁左心室短軸二維圖像后, 在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖,每組原始數據取連續3個心動周期的平均值, 超聲檢查的操作及分析均由不知道大鼠分組情況的專科醫生完成。測量左心室收縮末期直徑(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室舒張末期直徑 (left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室縮短分數(left ventricular fractional shortening, LVFS)。

2.6大鼠心肌組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測 按照試劑盒說明書測定SOD活性和MDA含量。BCA法測蛋白含量。

2.7大鼠心肌組織白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)含量測定 取制備好的組織勻漿，應用酶聯免疫吸附法按照試劑盒說明書測定IL-1β和TNF-α含量。BCA法測蛋白含量。

2.8透射電鏡觀察大鼠心肌超微結構變化 灌流結束后，取大鼠左心室心尖部約3.0 mm×4.0 mm×1.0 mm 大小組織，置于戊二醛磷酸緩沖液中固定30 min，然后改刀切成體積約1～2 mm3的小塊，4 ℃繼續固定24 h。常規脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結構。

3統計學處理

結 果

1大鼠心肌多胺含量變化

與Young組比較，Old組心肌腐胺含量明顯升高，精脒、精胺及總多胺池水平明顯下降，差異顯著(P<0.05)。與Old組比較，Old+Ex組心肌腐胺含量下降，精脒及總多胺池水平上升，差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1 實驗各組心肌組織中腐胺、精脒、精胺及總多胺池含量變化

*P<0.05vsYoung group;#P<0.05vsOld group.

2大鼠心肌ODC和SSAT活性變化

與Young組比較，Old組心肌ODC活性明顯下降，SSAT活性明顯上升，差異顯著(P<0.05)。與Old組比較，Old+Ex組心肌ODC活性明顯上升，SSAT活性明顯下降，兩者均有顯著差異(P<0.05)，見表2。

表2運動對衰老大鼠心肌組織ODC與SSAT活性的影響

GroupnODC(μmol·g-1·h-1)SSAT(μmol·g-1·h-1)Young8138．96±47．663116．6±553．79Old8107．28±11．71?6577．1±1066．15?Old+Ex7174．68±48．04#2984．1±197．49#

*P<0.05vsYoung group;#P<0.05vsOld group.

3大鼠心臟超聲變化情況

超聲心動圖測量結果顯示，與Young組比較，Old組左心功能明顯降低，表現為 LVEDD和LVESD 顯著增大, LVEF和LVFS顯著降低，差異顯著(P<0.01)；與Old組比較,Old+Ex組LVEDD和LVESD明顯減小, LVEF和LVFS 顯著提高，差異顯著(P<0.01)，見表3。

表3 心臟超聲檢測大鼠心臟功能

**P<0.01vsYoung group;##P<0.01vsOld group.

4大鼠心肌SOD活性及MDA含量測定

與Young組比較，Old組心肌組織SOD活力降低、MDA含量明顯升高，差異顯著(P<0.05)；與Old組比較，Old+Ex組心肌組織SOD活性增加，MDA含量降低，差異顯著(P<0.05)，見表4。

表4運動訓練對衰老大鼠心臟SOD活力和MDA含量的影響

GroupnSOD[103U·(gprotein)-1]MDA[μmol·(gprotein)-1]Young8333．37±54．990．61±0．14Old8257．84±75．93?0．84±0．28?Old+Ex7319．18±17．12#0．58±0．12#

*P<0.05vsYoung group;#P<0.05vsOld group.

5大鼠心肌TNF-α與IL-1β水平檢測

與Young組比較，Old組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯升高，差異顯著(P<0.05)；與Old組比較，Old+Ex組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯降低，差異顯著(P<0.05)，見表5。

表5運動對衰老大鼠心肌組織TNF-α和IL-1β水平的影響

GroupnTNF-α(ng·L-1)IL-1β(ng·L-1)Young615．89±3．7743．47±3．56Old828．41±6．09?62．35±7．64?Old+Ex617．54±3．98#46．52±5．68#

*P<0.05vsYoung group;#P<0.05vsOld group.

6透射電鏡觀察大鼠心肌超微結構變化

透射電鏡下可見Young組大鼠心肌肌絲排列整齊、肌節清晰，線粒體密集，線粒體嵴清晰、基質致密；Old組大鼠心肌肌絲排列不整齊，線粒體體積增大、基質疏松，并可見大量脂褐素顆粒沉積；Old+Ex組心肌肌節結構清晰，線粒體基質較致密，線粒體嵴排列整齊，偶見脂褐素顆粒，見圖1。

Figure 1. The ultrastructural changes in the myocardium of rats under transmission electron microscope (×5 000).A: Young group; B: Old group; C: Old+Ex group.

圖1透射電鏡觀察大鼠心肌超微結構的變化

討 論

大量流行病學資料及實驗研究均已證實適量運動可提高機體有氧代謝水平，增加心肌供氧量，促進衰老及疾病狀態下心臟功能的改善，降低心血管疾病的發生率和死亡率,延緩心臟衰老,但其確切機制尚未完全闡明[8]。多胺廣泛存在于生物體組織細胞內，參與體內許多病理生理過程。研究顯示，跑步運動12周可使結腸黏膜ODC mRNA的表達增加1.8倍，ODC的變化對減少結腸癌的發生有益[9]。另有文獻報道，適量運動(踏步運動、游泳運動)能夠上調大鼠骨骼肌、心肌ODC活性，促進多胺合成[10-11]，但對其作用沒有闡述。運動訓練對老齡心肌多胺代謝是否影響？以及內源性多胺在老齡心血管系統中的生理作用和病理意義，國內外尚未見報道。本研究通過觀察梯度運動對老齡大鼠心肌多胺代謝變化、心肌抗炎及抗氧化能力的影響，初步探討多胺在運動抗心肌衰老中的作用。

本研究結果顯示，與青年組比較，老齡組大鼠心肌SOD活力降低，MDA、TNF-α和IL-1β水平增加，老齡心臟LVEDD 與LVESD增大，LVEF與FS降低；6周梯度運動能明顯提高老年大鼠心肌組織中SOD活力，降低MDA及TNF-α和IL-1β水平，并且能明顯改善老齡大鼠的LVEDD 與LVESD降低以及LVEF與FS升高。這提示老齡大鼠心臟功能下降，心肌抗炎、抗氧化能力下降；梯度運動訓練通過上調老齡心肌抗氧化酶的活性，抑制心肌脂質過氧化反應及炎癥介質的生成，改善老齡大鼠心臟功能。

ODC 為多胺合成代謝的限速酶,ODC催化鳥氨酸生成腐胺,腐胺再依次在精脒、精胺合成酶的作用下生成精脒與精胺。多胺的分解代謝由另一限速酶 SSAT催化，SSAT催化精胺逆轉化為精脒，精脒逆轉化為腐胺的過程，由SSAT催化的反應可產生過氧化氫(H2O2)和 3-氨基乙醛(3-aminoaldehyde)2種有毒代謝副產物，二者均可引起組織細胞損傷[7]。正常狀態下，體內的多胺與細胞內的生物大分子，如DNA、RNA及蛋白質等結合在促進細胞生長、分化與增殖中發揮重要作用。已有研究證實增殖旺盛的組織細胞，如再生肝及腫瘤細胞等ODC活性增加，多胺水平升高[12-13]；本研究中我們觀察到老齡大鼠心肌ODC活性明顯降低，精脒、精胺及總多胺水平均明顯減少，低于Young組。我們推測衰老心肌多胺合成代謝下調，導致總多胺池減少可能是老化心肌的生物學改變之一。其他學者的研究也證實隨年齡增加哺乳類動物多種組織器官如，肝、腎、骨骼肌、心臟、肺等多胺水平降低，ODC活性也呈相同下降趨勢[2]。本研究還發現，老齡大鼠心肌多胺分解代謝限速酶SSAT活性明顯高于青年組(P<0.05)，說明老齡心肌多胺分解代謝被過度激活。SSAT過度激活一方面進一步削減細胞內多胺池，另一方面SSAT催化反應過程中產生的H2O2和3-氨基乙醛可造成心肌損傷。因此，老齡心肌多胺分解代謝激活可能參與了衰老心肌的氧化應激損傷。相關文獻支持我們的分析[14]。

本研究進一步觀察到，運動訓練能夠上調老齡大鼠心肌ODC活性/抑制SSAT活性，恢復老齡心肌總多胺池。ODC作為一種應激反應蛋白，可被多種應激事件如，冷熱刺激、缺血缺氧、運動等激活[15]。也有相關文獻報道運動能夠激活ODC促進骨骼肌及心肌多胺合成[10-11]。但目前尚未見運動對SSAT活性影響的報道。本研究提示，運動訓練可能通過某種機制調節心肌多胺代謝關鍵酶ODC與SSAT的活性，維持老齡心肌總多胺在適當水平，進而增強了心肌的抗炎、抗氧化能力。相關文獻亦證實多胺具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。Zhu等[16]報道小鼠腹腔注射精胺(10 mg/kg) 能明顯抑制內毒素誘導的血清中炎癥介質的釋放；Das等[17]的研究發現多胺可抑制幅射等所引起的DNA損傷和脂質過氧化。另有研究顯示多胺可通過清除羥自由基，維持谷胱甘肽和巰基的還原狀態，抑制線粒體通透轉運孔的開放等[18]。

總之，本研究顯示，梯度運動訓練可通過調節多胺合成與分解代謝關鍵酶的活性，維持老齡心肌總多胺水平，進而增強老齡心肌抗炎、抗氧化能力。本研究提示，維持老齡心肌多胺池在適當水平可能是運動延緩心肌衰老的部分機制之一。

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Effectsofexercisetrainingonmyocardialpolyaminemetabolisminagedrats

WANG Wei-wei1, XUE Guo1, ZHANG Hao1, ZHANG Wei-hua1, WANG Li-na1, LI Hong-xia1, LIN Yan2, XU Chang-qing1, ZHAO Ya-jun1

(1DepartmentofPathophysiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China;2DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalCollege,Qiqihar161006,China.E-mail:zhaoyajun1964@163.com)

AIM: To explore the effects of exercise training on myocardial polyamine metabolism in aged rats.METHODSWistar rats were divided into 3 groups: old+exercise group (Old+Ex), old group (Old) and young group (Young). High-performance liquid chromatography was used to test the content of myocardial polyamines (putrescine, spermidine and spermine). The activity of polyamine synthesis and catabolism rate-limiting enzyme ornithine decarboxylase (ODC) and spermidine/spermine acetyltransferase (SSAT) was analyzed by [14C] labeling. The level of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in the myocardium were detected by colorimetric method. The levels of TNF-α and IL-1β were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The cardiac functions were measured by echocardiography. The changes of myocardial ultrastructure were observed under transmission electron microscope.RESULTS(1) Compared with Young group, ODC activity decreased, SSAT activity increased, and the levels of spermidine, spermine and total polyamine were significantly decreased in Old group. SOD activity also decreased significantly, the content of MDA, TNF-α and IL-1β also increased dramatically in Old group. In the old rats, both left ventricular end-systolic diameter (LVESD) and end-diastolic diameter (LVEDD) increased, while left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional shortening (LVFS) decreased. (2) Compared with Old group, ODC activity increased, SSAT activity decreased, the levels of spermidine and total polyamine significantly increased, SOD activity increased significantly, and the content of MDA, TNF-α and IL-1β decreased dramatically in Old+Ex group. The functions of left ventricle also improved significantly in Old+Ex group. (3) Ultrastructural observations indicated that the myofilament and mitochondrial cristae were irregular and mitochondrial matrix density decreased in old rat heart. The cardiac sarcomere structure was clear, the mitochondrial matrix was dense and the mitochondrial cristae arranged in order in Old+Ex group.CONCLUSIONExercise training promotes polyamine synthesis metabolism and inhibits polyamine catabolism in the heart of aged rats, thus fighting against aging-induced myocardial polyamine decrease. Exercise training also improves the capacity of anti-inflammatory and antioxidant processes of aged heart. Maintaining the appropriate levels of myocardial polyamines may be a new mechanism to delay cardiac aging.

Exercise; Polyamines; Heart; Lipid peroxidation; Inflammation mediators; Aging; Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.002