新型腹腔降溫法對心肺復蘇后兔炎癥反應的影響*

魏紅艷， 李 欣， 廖曉星， 戴 瑄， 劉 榮， 李穎慶， 胡春林△

(1中山大學附屬第一醫院急診科，廣東 廣州 510080； 2廣州醫學院第一附屬醫院急診科，廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)09-1559-06

2012-04-13

2012-07-13

廣東省自然科學基金資助項目(No. S201040003615)；教育部博士點新教師基金資助項目(No. 20110171120066)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8500;E-mail：hu-chunlin@163.com

新型腹腔降溫法對心肺復蘇后兔炎癥反應的影響*

魏紅艷1， 李 欣1， 廖曉星1， 戴 瑄1， 劉 榮2， 李穎慶1， 胡春林1△

(1中山大學附屬第一醫院急診科，廣東 廣州 510080；2廣州醫學院第一附屬醫院急診科，廣東 廣州 510120)

目的觀察心肺復蘇(CPR)后不同降溫方法對自主循環恢復(ROSC)后兔炎癥反應的影響。方法48只新西蘭成年大白兔，采用交流電致顫的方式建立CPR模型， 依據降溫方式的不同，隨機分為常溫組(NT)、腹腔內降溫組(PC)、體表降溫組(SC)和頭部局部降溫組(LC)。觀察不同降溫方法對ROSC后血漿TNF-α和IL-6濃度的影響，ROSC后12 h取肝臟組織，Western blotting檢測NF-κB p65和NF-κB p50蛋白表達。記錄每組動物的存活時間并進行比較。結果ROSC后4 h、8 h和12 h，PC組血漿TNF-α水平顯著低于NT組；至12 h時PC組也顯著低于SC組和LC組(P<0.05)；ROSC后2 h、4 h、8 h和12 h，PC組血漿IL-6水平明顯低于NT組(P<0.05)，而與SC、LC組間無顯著差異。ROSC后12 h，PC組肝核蛋白內NF-κB p65和p50蛋白表達水平顯著低于其它各組(P<0.05)，而其它3組之間差異無統計學意義。ROSC后PC組動物的存活率顯著高于NT、SC和LC組(P<0.05或P<0.01)。結論CPR后腹腔降溫法可快速誘導亞低溫和降低腹腔內溫度，抑制肝臟內NF-κB的激活，降低血漿TNF-α和IL-6水平，減輕ROSC后全身炎癥反應，延長動物存活時間。

心肺復蘇; 低溫; 腹腔降溫法; 炎癥

隨著心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)技術的發展，心源性猝死患者的自主循環恢復(return of spontaneous circulation, ROSC)率有了極大提高，但是總的出院存活率還不高，大約75% ROSC患者死于復蘇后綜合征，過度的炎癥反應是引起這一綜合癥的重要機制。近年的研究表明亞低溫可以提高CPR病人的出院存活率和改善神經功能[1]。炎癥反應是缺血再灌注后引起組織損傷的重要機制之一[2]，在各種缺血再灌注損傷的模型中，低溫都顯示出了對這一過程的強大抑制作用，對炎癥反應的影響是亞低溫減輕缺血再灌注后組織損傷的重要機制。但臨床研究中亞低溫并沒有減輕ROSC后的炎癥反應[3]，可能和降溫方法有關。動物實驗發現ROSC后血漿致炎因子迅速升高，部分在1 h內達到峰值[3]，因而，ROSC后應迅速、有效地降溫才有可能減輕炎癥反應，擴大亞低溫的保護作用。

我們前期的研究表明CPR后肝臟可能是產生致炎因子的主要來源[4]，新型腹腔降溫法可直接作用于腹部，快速降低肝、脾臟器官的溫度，理論上具有更強的抑炎效果[5]。因此我們假設新型腹腔降溫法可能較其它降溫方法更能減輕ROSC后全身炎癥反應，從而改善預后。本研究觀察腹腔降溫法對ROSC后全身炎癥反應的影響，闡明CPR后經腹腔降溫的優勢，為該方法進入臨床奠定理論基礎。

材 料 和 方 法

1動物

48只新西蘭成年大白兔，雌雄不拘，由中山大學實驗動物中心提供，所有實驗經中山大學動物實驗倫理委員會批準。動物購進后在SPF級動物房飼養1周，實驗前晚禁食不禁水。動物麻醉：1%戊巴比妥鈉(Sigma)30 mg/kg，由耳緣靜脈注入，給予1/4的首劑量維持。

2動物模型的建立

按照我們前期的方法建立室顫心臟驟停CPR模型[1]。誘發室顫成功的標準為：動脈搏動消失，血壓迅速下降，接近0 mmHg，心電圖顯示室顫波形，持續室顫5 min后開始CPR。先給予2 min的心前區胸外按壓，按壓頻率200次/min，按壓深度為前后胸徑的1/3，同時給予腎上腺素20 μg·kg-1·(3 min)-1。按壓2 min后給予25 J的能量除顫(除顫儀，Cardiopace)，所有的胸外按壓均由同一實驗人員實施。反復進行上述CPR周期，如15 min未出現ROSC，宣布復蘇失敗。ROSC的標準為恢復室上性心率，平均動脈壓>60 mmHg持續10 min以上。

3實驗分組和溫度控制

48只兔根據隨機數字分為4組：①常溫治療組(normothermic treatment, NT)，ROSC后放置在37℃恒溫箱內，維持核心溫度在正常范圍內；②腹膜腔內降溫治療組(peritoneal cooling treatment, PC)，按照我們前期研究方法，ROSC后向兔腹腔內灌注80 mL/kg 4 ℃低溫液體進行誘導亞低溫和維持亞低溫[5]；③體表降溫治療組(surface cooling treatment, SC)，ROSC后在體表主要在頸部、腹股溝和胸腹腔周圍放置冰塊，依據降溫情況增減冰塊數量[6]；④頭部局部降溫治療組(local cooling treatment, LC)，ROSC后僅在頭部周圍放置冰塊。同時監測鼓膜溫度(tympanic temperature，TympT)和腹腔內溫度(peritoneal temperature, PerT)。本實驗中動物的核心溫度鼓膜溫度的正常范圍為(39.5±0.5)℃，目標溫度為33～35 ℃,達到目標溫度后維持亞低溫治療12 h。

4血漿炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)和白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)測定

誘發室顫前、ROSC后2、4、8和12 h取耳緣靜脈血，用ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6濃度，TNF-α和IL-6 ELISA 檢測試劑盒購自Unionhonest，操作按說明書進行。

5肝臟組織病理變化及核因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)活化情況檢測

ROSC后12 h，每組隨機通過過量麻醉的方式處死動物3只，取肝臟組織，HE染色觀察肝組織損傷及炎癥細胞浸潤情況，用Western blotting法檢測肝組織胞漿、NF- κB p65和NF-κB p50蛋白表達水平，并計算兩者的比例。Rabbit Anti-p65及p50購自北京博奧生物技術有限公司，胞漿內參照GAPDH抗體和核蛋白內參照PCNA抗體(Catalog No:10205-2-AP)購自Proteintech Group。

6動物存活時間的觀察

ROSC后觀察96 h，記錄每組動物的存活時間，計算、比較每組動物存活率的差異。

7統計學處理

結 果

1動物分組及CPR復蘇情況

48只新西蘭大白兔每組12只，所有動物均能成功誘發室顫，交流電刺激后動脈搏動消失，血壓迅速下降；停止交流電刺激后，心電圖顯示心室顫動波形，血壓接近0 mmHg。NT、PC、SC和LC組分別有9、10、9和10只動物復蘇成功，見表1，復蘇成功率組間沒有顯著差異。各組動物的基本生理參數之間沒有差異。

表1 各組動物的自主循環恢復情況比較

2溫度控制情況

誘導亞低溫階段NT組動物鼓膜溫度維持在38 ℃以上，其它3組均迅速下降，其中PC組溫度下降最為迅速，達到目標溫度的時間為(26±7)min，SC組和LC組達到目標溫度的時間分別為(60±9)min、(69±12)min。維持亞低溫階段除NT組外，其余各組鼓膜溫度均穩定地維持在33～35 ℃之間,見圖1。

誘導亞低溫階段NT組動物腹腔溫度維持38～39 ℃，LC組溫度稍降低，維持在38.5 ℃左右；其余2組腹膜溫度均明顯下降，SC組達到目標溫度的時間為(61±6)min；PC組平均10 min左右達到目標溫度，最低溫度為26 ℃。維持亞低溫階段NT組腹腔溫度維持在38～39 ℃之間，LC組維持在38 ℃左右，SC組維持在33～35 ℃之間，而PC組腹腔溫度始終低于鼓膜溫度1～2 ℃，維持在31～34 ℃之間，最低達到29 ℃,見圖2。

圖1誘導和維持亞低溫階段每組動物的鼓膜溫度變化趨勢

圖2誘導和維持亞低溫階段每組動物的腹腔溫度變化趨勢

3ROSC后各組血漿TNF-α和IL-6的水平變化

ROSC后各組動物均出現了明顯的炎癥反應，血漿TNF-α(表2)和IL-6(表3)的水平顯著升高，TNF-α升高至基礎值的4～5倍，IL-6升高2～3倍，兩者約在ROSC后4 h左右達到高峰，隨后逐漸下降。ROSC后的4、8、12 h，PC組血漿TNF-α水平顯著低于NT組，P<0.05；在ROSC后12 h時，PC組血漿TNF-α水平也顯著低于其它降溫組，P<0.05；PC組血漿IL-6水平在ROSC后2、4、8、12 h均明顯低于NT組，P<0.05；其它降溫組對ROSC后血漿IL-6水平的影響不明顯。

表2 自主循環恢復后各組動物血漿TNF-α的水平比較

*P<0.05vsother groups.

表3 自主循環恢復后各組動物血漿IL-6的水平比較

*P<0.05vsother groups.

4ROSC后各組肝組織病理變化

ROSC后12 h NT組、LC組肝組織內肝細胞索腫脹明顯，細胞邊界模糊，匯管區內可見大量的炎癥細胞浸潤，而SC組、PC組肝細胞腫脹不明顯，細胞邊界相對清晰，匯管區內炎癥細胞浸潤明顯減少，見圖3。

Figure 3. The pathological changes of liver after ROSC in each group (HE staining,×40).

圖3自主循環恢復后各組動物肝組織病理變化

5Westernblotting檢測肝臟組織內NF-κBp65和NF-κBp50蛋白水平

ROSC后12 h肝組織內核轉錄因子NF-κB明顯激活，組織內p65和p50蛋白表達水平升高，不同低溫治療方式對ROSC后肝組織內核轉錄因子NF-κB激活有明顯的影響。各組p65蛋白含量比較，PC組顯著低于其它各組，P<0.05，SC組、NT組和LC組之間無顯著差異，見圖4。各組肝組織內p50蛋白含量比較，與p65相似，PC組顯著低于其它各組，P<0.05，而其它3組之間差異無統計學意義，見圖5。

6不同降溫方法對動物存活率的影響

ROSC后各組動物的存活時間用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結果表明，PC組動物的累積生存率顯著高于其余各組(P<0.05或P<0.01)，即PC可延長動物的存活時間，見圖6。

討 論

ROSC后有大約75%患者死于復蘇后綜合征(post resuscitation syndrome, PRS)，主要表現為進展性的多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[7]。神經功能障礙和心力衰竭是這一綜合征的兩個主要構成部分。心跳驟停期間氧化應激損傷激活再灌注損傷過程中的代謝級聯反應(自由基的產生)和全身炎癥反應。多項臨床觀察研究表明PR-MODS和全身炎癥反應有關[8-9]。CPR后心肌內TNF-α迅速升高，高水平的TNF-α可使收縮期心肌細胞內鈣離子水平降低，影響心肌收縮功能，也參與心肌氧自由基的釋放，進一步增加TNF-α的產生[10]。CPR后顱內高水平的TNF-α，可使凋亡因子FasL和p53增加，通過多條途徑導致神經元細胞凋亡[11]，在CPR后繼發性腦損傷中發揮重要作用。

圖4自主循環恢復后各組動物肝臟組織胞漿和胞核內p65的表達

圖5自主循環恢復后各組動物肝臟組織胞漿和細胞核內p50的表達

Figure 6. The effects of different cooling methods on rabbit survival time after ROSC.n=12.

圖6不同降溫方法對自主循環恢復后動物存活時間的影響

TNF-α和IL-6由腸上皮細胞、肝臟的枯否氏細胞和肺內的巨噬細胞產生和釋放[12]?？莘袷霞毎侨梭w內最大的巨噬細胞群，占全身巨噬細胞的80%～90%，對炎癥因子的產生和釋放有重要的影響，其產生的細胞因子可以導致遠隔器官損傷。我們前期的研究結果也表明，肝臟可能是ROSC后炎癥因子的主要來源[4]。NF-κB是調節炎癥反應的樞紐，可促進炎癥因子IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、 TNF-α、干擾素-γ、細胞黏附分子如E-選擇素、細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecules, ICAM-1)、血管細胞間黏附分子-1 (vascular cellular adhesion molecules, VCAM-1)和病毒蛋白的轉錄。

亞低溫能改善CPR病人的存活率和神經功能與減輕炎癥反應有關，但臨床研究中亞低溫并沒有減輕ROSC后的炎癥反應[3]，可能和降溫方法有關。動物實驗發現ROSC后血漿致炎因子迅速升高，部分在1h內達到峰值[3]，因而，ROSC后應迅速、有效降溫才有可能減輕炎癥反應，擴大亞低溫保護作用。當前國內外常用的亞低溫治療方法分為體外降溫法和體內降溫法。體外降溫法大約需要300 min左右才能達到目標溫度，即使是被認為最有效的降溫方法——血管內降溫法，達到目標溫度也需3～4 h[13]。此外，Kuboki等[14]的研究表明肝臟枯否氏細胞內NF-κB的激活具有溫度依賴性，中度低溫(<33 ℃)較亞低溫(33～35℃)更能抑制NF-κB的激活，但全身中度低溫可能增加惡性心律失常的發生率，抵消低溫治療的益處[15]。本研究結果表明，ROSC后腹腔降溫法可快速誘導亞低溫和降低腹腔內溫度，鼓膜溫度30 min左右、腹腔溫度10 min左右就達到了目標溫度，并且在維持亞低溫過程中使腹腔局部保持中度低溫水平，從而避免了全身過低溫的副作用，這正是其獨特的優勢所在，因而較其體表降溫和頭部局部降溫方法更能減輕肝臟內NF-κB的激活，從而改善ROSC后的全身炎癥反應，延長動物的存活時間。

總之，CPR后腹腔降溫法可快速誘導亞低溫和降低腹腔內溫度，抑制肝臟內NF-κB的激活，降低血漿TNF-α和IL-6水平，減輕ROSC后全身炎癥反應，延長動物存活時間。

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Effectsofperitonealcoolingoninflammationaftercardiopulmonaryresuscitationinrabbits

WEI Hong-yan1, LI Xin1, LIAO Xiao-xing1, DAI Xuan1, LIU Rong2, LI Ying-qing1, HU Chun-lin1

(1DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510120,China.E-mail:hu-chunlin@163.com)

AIM: To explore the effects of different cooling methods on systemic inflammation after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in New Zealand rabbits.METHODSVentricular fibrillation in 48 adult New Zealand rabbits was induced by alternating current and was resuscitated after cardiac arrest for 5 min. The rabbits were randomly divided into 4 groups according to the way of cooling methods: normothermia group (NT), peritoneal cooling group (PC), surface cooling group (SC) and local cooling group (LC). The plasma concentrations of tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were measured in each group at different time points after return of spontaneous circulation (ROSC). The liver tissues were removed 12 h after ROSC, and the levels of NF-κB p65 and NF-κB p50 were tested by Western blotting. The survival time was recorded and compared 96 h after ROSC.RESULTSThe plasma concentration of TNF-α in PC group was lower than that in NT group 4 h, 8 h and 12 h after ROSC, and was also lower than that in SC group and LC group 12 h after ROSC. The level of IL-6 in PC group was lower than that in NT group 2 h, 4 h, 8 h and 12 h after ROSC, while there was no difference between the other 2 groups. The levels of p65 and p50 in PC group were lower than those in other groups (P<0.05), while there was no difference between the other 3 groups. The cumulative survival rate after ROSC in PC group was higher than that in NT group, SC group and LC group.CONCLUSIONThe novel peritoneal cooling rapidly induces and maintains mild hypothermia, and decreases the peritoneal temperature quickly, thus inhibiting liver NF-κB activation, reducing the releases of TNF-α and IL-6, subsequently relieving systemic inflammation after ROSC and prolonging rabbit survival.

Cardiopulmonary resuscitation; Hypothermia; Peritoneal cooling; Inflammation

R541.7+8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.005