黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡及JNK3表達的影響*

劉莎莎， 高維娟， 錢 濤， 張 霞

(1承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000； 2河北化工醫藥職業技術學院，河北 石家莊 050026)

1000-4718(2012)09-1582-07

2012-02-10

2012-07-12

國家自然科學基金資助項目(No.81072923)

△通訊作者Tel: 0311-85110168 E-mail:gwj6088@163.com

黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡及JNK3表達的影響*

劉莎莎1， 高維娟2△， 錢 濤1， 張 霞1

(1承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000；2河北化工醫藥職業技術學院，河北 石家莊 050026)

目的觀察黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡及c-Jun N末端激酶3(JNK3)表達的影響。方法四血管阻斷法制備腦缺血再灌注大鼠模型。設假手術組、腦缺血再灌注模型組(模型組)、腦缺血再灌注模型+黃芪注射液組(黃芪注射液組)和腦缺血再灌注模型+黃芪注射液溶劑對照組(溶劑對照組)。除假手術組外其余3組根據再灌注時間不同又分為0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h 7個亞組。采用TUNEL法檢測海馬神經元凋亡，Western blotting法檢測海馬組織JNK3蛋白變化，real-time PCR法檢測海馬組織JNK3 mRNA 的表達變化。結果與假手術組比，模型組大鼠各個時點凋亡細胞數均增多(P<0.05)；與模型組比，黃芪注射液組各個時點的細胞凋亡數明顯減少 (P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組各個時點的細胞凋亡數無明顯變化 (P>0.05)。除120 h外，模型組各時點海馬組織JNK3蛋白及mRNA表達均較假手術組增加(P<0.05)；與模型組相比，黃芪注射液可減弱除120 h之外的各時點JNK3 蛋白及mRNA的表達 (P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組則無明顯變化(P>0.05)。結論黃芪注射液可抑制腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡，其抗凋亡機制可能與下調JNK3 mRNA及蛋白表達有關。

腦缺血再灌注； 黃芪注射液； c-Jnu N末端激酶3； 海馬； 細胞凋亡

腦缺血后恢復腦血流是治療腦缺血最關鍵的方法，但再灌注可加重缺血腦組織的損傷，而這種損傷以細胞凋亡為主。目前腦缺血再灌注損傷后神經細胞凋亡的發生機制仍不十分清楚，多數學者認為神經細胞的凋亡是凋亡相關基因表達的結果，并受許多內外因素的調節。c-Jun N末端激酶3(c-Jun N-terminal kinase 3,JNK3)是一種神經特異性JNK亞型，其在神經系統損傷中具有重要的作用[1]。黃芪注射液作為臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，可抑制細胞凋亡的發生[2]，但具體機制尚未闡明。本課題組前期實驗證實，黃芪注射液可抑制離體培養的缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡，但在在體情況下，黃芪注射液是否可抑制腦缺血再灌注大鼠海馬神經細胞凋亡尚屬未知，因此本實驗通過觀察黃芪注射液對全腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡及JNK3表達的影響，以探討其發揮腦保護作用的分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級健康SD雄性大鼠258只，體重220～280 g，由天津山川紅實驗動物科技有限公司提供，許可證號為SCXK(津)2009-0001。

1.2主要試劑和儀器 原位細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche；蛋白酶K購自Sigma；兔抗大鼠JNK3單克隆抗體購自Cell Signaling；小鼠抗大鼠β-actin購自Santa Cruz；JNK3引物及探針由上海基康生物技術有限公司設計合成；Premix Ex TaqTM實時熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產，20 mL/支(每1 mL相當于2 g生藥)，生產批號為國藥準字Z51021776；其它試劑為國產分析純。TDL-40B離心機為上海安亭科學儀器制造廠產品；DYY-6B型穩壓穩流電泳儀為北京六一儀器廠產品；SLAN熒光定量PCR檢測系統為上海宏石醫療科技有限公司產品。

2方法

2.1動物分組與造模 SD大鼠適應性飼養1周后隨機分為4組：假手術組、腦缺血再灌注模型組(模型組)、腦缺血再灌注模型+黃芪注射液組(黃芪注射液組)和腦缺血再灌注模型+黃芪注射液溶劑對照組(溶劑對照組)，除假手術組外其余各組根據再灌注后不同時間再分為0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h 和120 h 7個亞組，每個亞組12只動物。采用四血管阻斷法制備腦缺血再灌注大鼠模型：4%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后將大鼠俯臥位固定于操作臺上，在枕骨后切開皮膚，逐層分離暴露雙側第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。將大鼠仰臥固定，行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈，以“4”號絲線穿線備用，縫合切口。術后恢復24 h用無創微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，30 min后松開微動脈夾恢復血流。以大鼠翻正反射消失、瞳孔散大作為全腦缺血成功的標準。假手術組只做皮膚切口和組織分離。黃芪注射液組腦缺血前30 min腹腔注射黃芪注射液6 mL/kg[3]，其中24 h、72 h、120 h組術后每隔24 h追加給藥1次，以確保穩定的血藥濃度。黃芪注射液溶劑對照組腹腔注射與黃芪注射液等量的無菌去離子水。

2.2標本制備 從各組大鼠中隨機選取6只，4%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織，石蠟包埋，冠狀切片，制成4 μm厚連續切片；其余各組大鼠4%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速斷頭處死，在低溫修塊臺上分離出雙側海馬組織，置于Eppendorf管中，-80 ℃保存，備用。

2.3原位細胞凋亡檢測(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL) 將石蠟切片二甲苯脫蠟、乙醇脫水、蒸餾水洗2次，各5 min，PBS(0.1 mol/L，pH 7.4)洗5 min，蛋白酶K(10 mg/L)滴加切片，37 ℃濕盒溫育15 min，PBS洗3次，各5 min，濾紙吸干，將3%H2O2滴加切片，以除去內源性過氧化物酶，37 ℃濕盒溫育30 min，PBS洗3次，各5 min，滴加TdT緩沖液和末端脫氧核糖核酸轉移酶25 μL，37 ℃濕盒溫育60 min，PBS洗3次，各5 min，含辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的抗熒光素抗體37 ℃濕盒中避光孵育30 min，PBS洗3次，各5 min， DAB顯色5～10 min，流動自來水充分沖洗終止顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。凋亡細胞核呈棕黃色染色為陽性。陰性對照TUNEL反應液中不加TdT，余反應同前。在400倍光鏡下計數海馬CA1區中1/3段內TUNEL染色陽性細胞數。定量分析方法為：光鏡下計算凋亡指數(apoptotic index, AI)。AI = 凋亡細胞數/總細胞數×100% 。

2.4Western blotting法檢測海馬組織JNK3蛋白表達 稱取海馬組織，提取總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，取25 μg樣品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白用半干電轉移法轉移到PVDF膜上，5% BSA封閉過夜，兔抗大鼠JNK3單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床孵育2 h。山羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)4 ℃搖床孵育1 h。洗膜后，采用化學發光法顯色，用凝膠分析軟件Quantity One進行分析，測定各條帶灰度值，取與β-actin的比值，反映目的蛋白的表達水平。

2.5Real-time PCR法檢測海馬JNK3 mRNA表達 稱取海馬組織，用TRIzol一步法提取RNA，按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明逆轉錄為cDNA。取2 μL cDNA進行熒光定量PCR，25 μL反應體系含Taq酶12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，3 μmol/L TaqMan-MGB 探針1 μL，ddH2O 8.5 μL。內參照GAPDH上游引物5′-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3′，下游引物5′-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3′，擴增片段長度為134 bp。探針序列5’-(FAM) CCACGGCAAGTTCAACGGCACAGT (Eclipse)-3’。JNK3上游引物5′-CGGATTCCGAGCACAATAAAC-3′，下游引物5′-AGGGTCGTACCAAACGTTGATGT-3′，擴增片段長度為137 bp。探針序列5′-FTAAAGCCCAGCCAAGCCP-3′。反應條件為：95 ℃預變性60 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s,擴增40個循環，在60 ℃讀取熒光。陰性對照將cDNA模板換成等體積的ddH2O。絕對定量的標準曲線制作：將標準品分別稀釋107、106、105、104、103作為模板，反應液的配置、反應條件和參數與PCR相同。結果檢測：熒光信號檢測點選在60 ℃反應后單點接收熒光信號，反應結束后計算機自動描出標準品系列稀釋液的擴增曲線，并根據標準曲線得出模板中內參照基因和目的基因的拷貝數。

3統計學處理

結 果

1黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡的影響

TUNEL陽性染色為細胞核呈棕黃色顆粒，假手術組偶見數個散在的陽性細胞。模型組在0 h和0.5 h僅見少許陽性細胞，隨再灌注時間延長于2 h開始增多，24 h達高峰，到再灌注后72 h凋亡細胞的數量開始下降；與模型組比，黃芪注射液組相應時點的凋亡細胞數減少(P<0.05)，而黃芪注射液溶劑對照組無明顯差異(P>0.05)，見圖1、2。

2黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白表達的影響

Western blotting實驗結果顯示，于再灌注后0 h即出現海馬組織JNK3表達增強，隨再灌注時間延長表達逐漸增多，至再灌注后24 h達高峰，并于再灌注后72 h開始下降。與假手術組比，除120 h外模型組各時點均有顯著差異(P<0.05)；與模型組比，黃芪注射液組除120 h外其余各時點JNK3的表達均降低(P<0.05)；而黃芪注射液溶劑對照組則無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

3黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3mRNA表達的影響

實時熒光定量PCR結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠于再灌注后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h和72 h JNK3 mRNA的表達明顯增高(P<0.05)，120 h組無明顯差異(P>0.05)；與模型組相比，黃芪注射液組除120 h外的各時點JNK3 mRNA的表達均降低(P<0.05)；而黃芪注射液溶劑對照組則無明顯差異(P>0.05)，見圖4～6。

討 論

腦血管病是臨床常見病，多發病，是當前人類疾病三大死亡原因之一，是首位致殘因素，其中缺血性腦血管病約占全部腦卒中的70%[4]。缺血性腦血管病尤其是缺血后的再灌注損傷對人類健康危害極大，神經細胞凋亡是缺血再灌注損傷后細胞死亡的重要形式。細胞凋亡是有核細胞在一定條件下啟動其自身內部機制，通過內源性核酸內切酶的激活而發生的細胞死亡過程，主要以細胞皺縮、胞核凝聚以及DNA鏈在核小體間被活化的核酸內切酶切斷、形成180～200 bp等倍體的DNA片段(寡聚核小體)為特點。本研究發現腦缺血再灌注后，在對缺血敏感的海馬腦區可檢測到較多的凋亡細胞，表明細胞凋亡是缺血性腦損傷中細胞死亡的途徑之一，與我們既往研究結果一致[5]。此外本研究還發現黃芪注射液可減少腦缺血再灌注后的神經細胞凋亡。

腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的發生機制與興奮性氨基酸、鈣超載、自由基增多等有關[6]，但更重要、更直接的是凋亡細胞內活躍的基因表達。腦缺血再灌注損傷與其后發生的細胞凋亡之間必須要通過相應的信號轉導通路來聯系，其中MAPK信號通路是神經細胞凋亡發生的重要環節。JNK信號通路是MAPK家族重要成員之一，它在細胞受到脅迫性刺激而發生凋亡的過程中發揮重要的作用[7]，抑制JNK信號通路可明顯抑制神經細胞凋亡，從而減輕腦缺血再灌注損傷[8]。JNK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在脊椎動物，有3種編碼JNK的基因jnk-1、jnk-2和jnk-3[9]，其相應的編碼產物JNK1和JNK2在各種組織細胞中廣泛表達，而JNK3則主要表達于腦組織[10]。JNK3是腦缺血再灌注期間神經細胞凋亡的關鍵信號[11]。葉冬青等[12]研究表明，缺氧缺糖/復氧復糖可通過增加JNK3的表達而誘發神經元凋亡。在自由基、興奮性氨基酸等應激刺激下，可激活JNK通路的關鍵激酶，即MAPK/ERK激酶類的MKK4 (mitogen-activated protein kinases kinases 4, MKK4)、MKK7 (mitogen-activated protein kinases kinases 7, MKK7)和MAPK/ERK激酶的激酶類的MEKK1,2,3,4 (mitogen and extracellular kinase kinase 1,2,3,4,MEKK1,2,3,4)。最終導致JNK三肽區的酪氨酸與蘇氨酸雙磷酸化，從而使其活化并轉移到細胞核[13]。激活的JNK通過刺激其下游底物改變線粒體通透性轉換孔(perme ablity transition pore, PTP)的通透性，促使細胞色素C(cytochrome C, CytC)釋放入胞漿，進入胞漿的CytC與胞漿的凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf - 1)以及caspase-9前體(pro-caspase-9)結合，在ATP存在條件下形成“凋亡體”復合物(CytC+Apaf-1+pro-caspase-9)，并由此激活caspase-9[14]，活性caspase-9裂解并激活caspase-3，caspase-3激活后一方面作為蛋白酶直接降解底物，另一方面激活其它caspase蛋白酶類，如caspase-6、caspase-7等，從而使細胞走向凋亡。

Figure 1. The effect ofAstragalusinjection on neuronal apoptosis in hippocampal CA1 region of cerebral ischemia reperfusion rats (TUNEL, ×400).

圖1黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡的影響

圖2黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區神經元凋亡指數的影響

圖3黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3蛋白表達的影響

Figure 4. Real-time PCR standard curves. A: GAPDH; B: JNK3

圖4實時定量PCR標準曲線

Figure 5. Amplification curves of GAPDH and JNK3 by real-time PCR.A: GAPDH; B: cerebral ischemia reperfusion group; C: ce-rebral ischemia reperfusion+Astragalusinjection group; D: cerebral ischemia reperfusion+vehicle group.

圖5實時定量PCR擴增曲線

圖6黃芪注射液對腦缺血再灌注大鼠海馬組織JNK3mRNA表達的影響

本實驗結果顯示，腦缺血再灌注模型組大鼠海馬組織JNK3的表達隨再灌注時間的延長逐漸增多，至24 h達到高峰后逐漸下降，與神經細胞凋亡趨勢相一致，說明腦缺血再灌注引起的神經細胞凋亡可能與JNK3的過度激活有關。同時結果顯示，黃芪注射液可顯著抑制JNK3的表達，因此我們推測，黃芪注射液抑制腦缺血再灌注后神經細胞凋亡可能與其抑制JNK3的表達有關。黃芪注射液是臨床治療缺血性腦血管病的常用藥物，療效良好，但作用機制尚未完全闡明。有研究證實，黃芪注射液具有降低腦缺血再灌注后腦組織的興奮性氨基酸含量、抗自由基損傷、增加NO含量、抑制Bax 蛋白表達等作用。黃芪注射液調節凋亡相關蛋白JNK3的表達及抑制腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的發生可能與其具有上述作用有關。

綜上所述，黃芪注射液可通過下調JNK3的表達，抑制腦缺血再灌注引起的細胞凋亡，從而發揮腦保護作用。

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EffectsofAstragalusinjectiononneuronalapoptosisandexpressionofJNK3inrathippocampusaftercerebralischemiareperfusion

LIU Sha-sha1, GAO Wei-juan2, QIAN Tao1, ZHANG Xia1

(1DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China;2HebeiChemical&PharmaceuticalCollege,Shijiazhuang050026,China.E-mail:gwj6088@163.com)

AIM: To investigate the effects ofAstragalusinjection on neuronal apoptosis and expression of c-Jun N-terminal kinase 3 (JNK3) in the rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion.METHODSThe rat model of cerebral ischemia reperfusion was set up by a four-vessel occlusion method. The SD rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group, cerebral ischemia reperfusion group (model group), cerebral ischemia reperfusion+Astragalusinjection group (Astragalusinjection group) and cerebral ischemia reperfusion+vehicle group (vehicle group). The rats in model group,Astragalusinjection group and vehicle group after transient global cerebral ischemia (30 min) were then divided into 7 subgroups according to the reperfusion time of 0 h, 0.5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 72 h and 120 h. The apoptosis of the neuron in the hippocampus was measured by the method of TUNEL staining. The expression of JNK3 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blotting,respectively.RESULTSCompared with sham operation group, the number of apoptotic neurons increased in model group (P<0.05). Compared with model group, the number of apoptotic neurons decreased obviously inAstragalusinjection group (P<0.05). Compared with sham operation group, the expression of JNK3 at mRNA and protein levels in the hippocampus increased obviously in model group at all time points except 120 h (P<0.05). Compared with model group, the expression of JNK3 at mRNA and protein levels in the hippocampus decreased obviously inAstragalusinjection group at all time points except 120 h (P<0.05).CONCLUSIONAstragalusinjection decreases neuronal apoptosis in rat hippocampus after cerebral ischemia reperfusion by inhibiting the expression of JNK3 at mRNA and protein levels.

Cerebral ischemia reperfusion;Astragalusinjection; c-Jun N-terminal kinase 3; Hippocampus; Apoptosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.009