海洛因誘導的條件性位置偏愛大鼠額葉聯絡皮層腦電的無線遙測及其分析*

潘群皖， 黃 磊， 朱再滿， 李 敏， 李 晶， 周鴻銘

(皖南醫學院 1生理教研室， 2麻醉與影像設備教研室，安徽 蕪湖 241000)

1000-4718(2012)09-1589-08

2012-04-17

2012-07-11

安徽省自然科學基金資助項目(No.090413096; No.10040606Q66)

△通訊作者 Tel： 0553-3932473; E-mail： panqunw@163.com

海洛因誘導的條件性位置偏愛大鼠額葉聯絡皮層腦電的無線遙測及其分析*

潘群皖1△， 黃 磊2， 朱再滿1， 李 敏1， 李 晶1， 周鴻銘1

(皖南醫學院1生理教研室，2麻醉與影像設備教研室，安徽 蕪湖 241000)

目的利用條件性位置偏愛(CPP)視頻系統結合腦電無線遙測技術，記錄海洛因誘導的CPP大鼠額葉聯絡皮層(FrA)區的腦電變化，分析其與覓藥行為之間的關系。方法對大鼠FrA區進行腦立體定位電極埋藏，并分成對照組和海洛因誘導CPP組，后者制作海洛因依賴模型。利用無線遙測技術，分別記錄2組大鼠黑白箱停留、黑-白穿梭和白-黑穿梭時大鼠FrA區腦電變化，分析其各波相對功率和百分比的差異。結果海洛因誘導的CPP組大鼠黑白箱停留時遙測腦電各波相對功率和百分比，與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，但海洛因誘導的CPP大鼠穿梭時左側FrA腦電波呈現δ波減少、β波和β2波增加的改變(P<0.05，P<0.01)，尤以黑-白箱穿梭明顯，而對照組大鼠穿梭時則表現出截然相反的腦電變化。結論大鼠左側FrA區慢波減少、快波增加的特異性改變，可能與海洛因誘導的CPP大鼠戒斷狀態下穿梭覓藥行為及其動機形成有關。

海洛因； 條件性位置偏愛； 額葉聯絡皮層

海洛因誘導所產生的條件性位置偏愛(conditioned place preference, CPP)和覓藥行為，與大腦前額皮層的神經元功能及其突觸間基質蛋白有關[1]。相關實驗表明，內側前額皮層(medial prefromal cortex，mPFC)腹側部神經突觸后膜α-氨基羥甲基噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,AMPA)亞型受體即谷氨酸受體2(glutamate receptor 2,GluR2)的可塑性與大鼠暗示性海洛因自給藥行為有關，GluR2下調可減弱海洛因覓藥行為[2]。Peters等[3]發現，mPFC背側邊緣前皮質(prelimbic cortex，PrL)能誘發恐懼和覓藥行為的產生，而mPFC扣帶皮層(cingulate cortex，Cg)則產生相反的效應。Bossert等[4]新近研究表明，PrL和Cg區可增強大鼠自給藥環境與海洛因獎賞相結合所誘導的覓藥行為，mPFC腹側部某些Fos蛋白表達陽性、被稱為神經元集群(neuronal ensembles)的散在神經元，可編碼和調控背側PrL和Cg區自給藥環境與海洛因獎賞結合的聯合學習。大鼠額葉聯絡皮層(front association cortex，FrA)毗鄰mPFC，其Fr2區(shoulder cortex)屬于背側mPFC，大鼠海洛因覓藥行為狀態下FrA腦電實時記錄及其分析，迄今未見報道。本實驗利用CPP視頻系統結合腦電無線遙測技術，觀察海洛因誘導的CPP大鼠FrA區腦電的變化。

材 料 和 方 法

1動物

選用清潔級Wistar大鼠(南京市江寧區青龍山動物繁殖場，許可證號為SCXK蘇2001-0001)33只，雌雄不限，體重290～320 g，常規飼養，自由進食水。

2方法

2.1大鼠FrA區電極埋藏 在20%氨基甲酸乙酯麻醉狀態下，行大鼠慢性電極埋藏手術。術中篩選顱骨前囟至人字縫距離>9 mm的大鼠做電極埋藏，左右側FrA定位為：前囟+5 mm，矢狀縫旁開2 mm，深度2.5 mm[5]。電極使用0.3 mm漆包鎳鉻絲。左右側電極埋藏后，切口處撒青霉素粉少許，連同置于頭皮下組織的接地電極用自凝牙科水泥固定，封閉切口。術后5 d內大鼠室內溫度控制在24℃左右，連續3 d肌注青霉素4×105U預防感染。

2.2海洛因誘導CPP大鼠模型制作及其確定 將做過FrA電極埋藏手術的17只大鼠，飼養10 d以上，作為對照組，同時選8只非手術大鼠(非手術組)，在實驗前均放入CPP視頻黑白箱內(JLBehv條件性位置偏愛視頻分析系統，上海吉量軟件科技有限公司生產)習服3 d，每天1次，每次45 min。習服結束后，正式開始大鼠黑、白箱 CPP實驗測定。將白箱作為伴藥箱，2組大鼠在白箱注射生理鹽水，然后任其自由穿梭于黑白箱。利用視頻觀察和軌跡圖自動記錄數據，統計每只大鼠黑、白箱停留時間和百分比。每次測定時間15 min，連續7 d。

8只FrA已埋藏電極的大鼠CPP箱中習服3 d后，采用伴藥箱給藥方法，制作海洛因誘導CPP模型，設為海洛因誘導CPP組。大鼠被趕至白箱(伴藥箱)內皮下注射海洛因，第1 d總量0.5 mg/kg，以后每天注射2次，每次遞增0.25 mg/kg[6]。注射藥物后，繼續將大鼠置于白箱內45 min。連續注射約5～9 d后，于次日注射藥物前，同上測定該組大鼠15 min黑、白箱CPP相關數據。將海洛因誘導組大鼠15 min CPP數據與非手術組大鼠、對照組大鼠做CPP數據團體對照分析，同時，做大鼠海洛因誘導前后CPP數據自身對照分析，以確定大鼠伴藥箱位置偏愛的形成。

此外，海洛因誘導大鼠注射藥物5 d后，觀察其戒斷癥狀，按栁田知司評定方法打分，總分在20分以上為戒斷癥狀明顯，結合上述CPP實驗，確定大鼠CPP及其藥物依賴是否形成。

2.3大鼠左右側FrA自發腦電的無線遙測 通過腦電無線遙測系統及其軟件(BW-200型生理無線遙測系統，成都泰盟科技有限公司生產)，記錄對照組和海洛因誘導CPP組大鼠左右側FrA自發腦電。將無線遙測發射子用綁帶固定在大鼠背部，打開發射子磁開關，輸入端兩電極分別接地電極和左、右側FrA埋藏電極，此時發射子自動采集并發射出左、右側FrA自發腦電，通過智能接收機解碼，經網絡中心機輸送至電腦，利用系統服務軟件記錄和處理腦電信號。

3統計學處理

結 果

1海洛因誘導組大鼠白箱CPP的確定

各組大鼠置于CPP視頻箱內自由穿梭，見圖1，分別測定非手術組大鼠、對照組和海洛因誘導的CPP組大鼠黑白箱停留時間及其百分比，描記軌跡圖。結果表明:海洛因誘導的CPP組大鼠與其它組相比，白箱給藥7 d后，大鼠即可產生伴藥箱CPP(P<0.05，P<0.01)，見表1。此外，已編號的海洛因誘導CPP組大鼠通過注射藥物前、后自身對照，以白箱停留時間較前大于50%為標準，觀察到一些大鼠海洛因誘導5 d后，CPP現象即逐漸出現，但也有個別大鼠海洛因誘導12 d才出現CPP。按栁田知司評定方法，海洛因誘導CPP組大鼠戒斷癥狀明顯，主要表現為震顫、洗面、甩頭、直竄和怪異動作、磨牙、噴嚏、咬物、眼分泌物增加、體重減輕等。

Figure 1. Rat shuttle in black(left) or white(right) chamber of conditioned place preference(CPP)video boxes(A)and the rat trace maps recorded through automatic recording system (selected from 8#rat of heroin-induced group) (B).

圖1大鼠在CPP視頻系統黑、白箱中活動和穿梭的圖象及系統自動描記的大鼠軌跡圖

表1 海洛因誘導的CPP組大鼠黑白箱活動時間(15 min)分析

*P<0.05，**P<0.01vsnon-operated group;#P<0.05，##P<0.01vscontrol group.

2海洛因誘導的CPP大鼠FrA區黑、白箱無線遙測腦電及其分析

2.1大鼠黑、白箱停留狀態時遙測腦電分析 對照組大鼠和海洛因誘導的CPP組大鼠分別于視頻黑、白箱內做左右側FrA腦電無線遙測，記錄原始腦電，基于快速傅立葉變換，獲取腦電各波百分比。通過MatLab軟件對2組大鼠不同狀態下的腦電信號進行功率譜分析并歸一化強度，基于小波包技術分別從2種狀態下的腦電信號里提取出各自4個節律的時域波形圖，見圖2。通過2組大鼠遙測腦電功率譜和快速傅里葉分析，結果表明海洛因誘導CPP大鼠在黑、白箱停留狀態時，與對照組大鼠比較，左右側FrA腦電δ、θ、α、α1、α2、β、β1、β2波相對功率和百分比沒有顯著差異(P>0.05)。

2.2大鼠穿梭時FrA遙測腦電的特征 分別無線遙測2組大鼠黑-白穿梭和白-黑穿梭時腦電，見圖3。選擇對照組和海洛因誘導的CPP組大鼠穿梭時腦電經快速傅立葉分析，并與海洛因誘導的CPP組大鼠黑、白箱停留狀態下各腦電波百分比進行對比，見圖4。結果表明，對照組大鼠除白-黑穿梭時，其右側FrA腦電無顯著變化外(P>0.05)，其余腦電均呈現出δ波百分比增加，β、β1、β2、α1、α1和α2波百分比減少的趨勢(P<0.05，P<0.01)，而海洛因誘導的CPP組大鼠穿梭時，腦電則表現出δ波百分比降低、β波增加的相反變化，且主要發生在左側FrA(P<0.05)。

2.3海洛因誘導的CCP組大鼠和對照組大鼠穿梭時腦電的比較 2組大鼠穿梭時的腦電波百分比變化見圖5。與對照組大鼠穿梭時腦電比較，海洛因誘導的CPP組大鼠除白-黑穿梭時右側FrA腦電無顯著差異外(P>0.05)，其余均呈現FrA區δ波百分比減少(P<0.05，P<0.01)、β波和β2波增加(P<0.05，P<0.01)的改變，以左側FrA為主，尤其是在黑-白箱穿梭時明顯，除β波增加外，α、α1和α2波也增加，各波相對功率譜測定表現出相同的改變。相比之下，對照組大鼠穿梭時則表現出截然相反的腦電變化，即δ波增加(P<0.01)，β波和β2波減少。

Figure 2. The δ，θ，α and β rhythm of original EEG based on wavelet packets extracted from 8#rat (A) and the spectrum of original EEG from 8#rat (B).

圖28號大鼠原始腦電小波包δ、θ、α、β節律提取和原始腦電頻譜圖

討 論

神經生理學家Kornhuber提出，隨意運動的設想起源于皮層聯絡區，經小腦和基底神經節編制運動計劃及程序后，輸送至皮層軀體運動區，通過皮質-脊髓束發動隨意運動。海洛因誘導大鼠所形成的白箱CPP覓藥行為，實際上是一種隨意運動行為，其運動的設想及其覓藥意識的形成，應該源于皮層聯絡區。根據這一原理，我們首先將研究焦點放在了皮層聯絡區面積較大的FrA腦區，該區毗連mPFC腦區，后者被公認為與海洛因獎賞效應及其覓藥行為密切相關。本文將CPP視頻檢測系統與腦電無線遙測技術相結合，較好地記錄了大鼠在CPP狀態下的實時遙測腦電，并利用非線性時頻信號小波分析法和快速傅里葉分析手法，試圖尋找出大鼠在海洛因誘導的CPP行為狀態下，FrA區域可能出現的腦電改變。

Figure 3. The EEG recorded on FrA by wireless telemetry while 14#rat with heroin-induced CPP stayed in black or white chamber (the timeline was compressed by 5 times) (A) and shuttled between black-white chambers or white-black chambers (the timeline was compressed by 20 times) (B).

圖3海洛因誘導的CPP組14號大鼠黑、白箱停留時的遙測腦電以及該大鼠黑-白穿梭和白-黑穿梭時的遙測腦電

具有明顯CPP行為的大鼠，在海洛因戒斷狀態下，任其在黑或白箱內自由行走或停留，實時遙測大鼠左右側FrA區腦電波，結果表明其腦電δ、θ、α、α1、α2、β、β1、β2節律百分比及其相對功率，與對照組大鼠比較，基本沒有顯著差異。這與先前所報道的嗎啡誘導產生CPP的大鼠，左右側皮層δ、θ、α1、α2、β1、β2腦電波及絕對功率降低的結果[7]似乎相矛盾。我們認為，這種差別可能與測定腦電的時間以及大鼠當時的行為狀態有關。本實驗發現在給大鼠注射海洛因后約2 h內，大鼠基本上處于安靜嗜睡樣狀態，全身佝僂，激惹閾高，此時遙測腦電可見腦電波和相對功率降低。2 h后，大鼠逐漸蘇醒活動，并出現怪異動作和逐步變得煩躁，我們所遙測的腦電，基本上是取此一戒斷時段，一般選用作為分析的腦電，多為記錄較為平穩，即大鼠在黑白箱處于相對安靜狀態下的實時腦電。這種腦電相當于人類在海洛因依賴狀態下，毒癮尚沒有發作，且處于安靜時的腦電，估計可能與正常人腦電差別不大。由于初次進行腦電無線遙測實驗，加上大鼠運動隨意性較強，在記錄過程中沒有將2組大鼠在箱內安靜和活動狀態加以標記區分，因此，2種狀態下腦電波統計學分析未能單獨做出。

黑、白箱之間穿梭活動是大鼠活動狀態下的一種特殊表現。快速傅里葉分析表明，海洛因誘導CPP大鼠在兩箱穿梭時所遙測的腦電波百分比，與其分別停留在黑、白箱內的腦電比較，除白-黑箱穿梭右側FrA區腦電百分比無顯著差異外，其余FrA區腦電均顯示δ波減少，β波和β2波增加，尤以左側顯著。新近皮層fMRI成像報道，海洛因吸食者左側背外側額葉皮層低頻率振蕩波幅降低，右側未發現明顯改變[8]。為了明確左側FrA這種變化趨勢是否與穿梭覓藥行為有關，我們將海洛因誘導的CPP大鼠穿梭時的遙測腦電，與對照組大鼠穿梭時的遙測腦電進行比較，結果表明，海洛因誘導的CPP大鼠穿梭時，除白-黑穿梭時右側FrA腦電無改變外，其余FrA區腦電均顯示δ波百分比減少、β和β2波增加趨勢，尤以左側FrA顯著，如黑-白箱(伴藥箱)穿梭時，除β波增加外，α、α1和α2波也明顯增加。對照組大鼠穿梭時則表現出截然相反的腦電變化，即δ波節律百分比增加，β和β2波減少。上述腦電變化提示大鼠FrA區δ波減少、β波和β2波增加，即慢波減少、快波增加的特異性改變，尤其是左側FrA區腦電的改變，可能與海洛因誘導的CPP大鼠戒斷狀態下穿梭覓藥行為及其動機形成有關。

Figure 4. Percentage analysis of telemetry EEG waves recorded on FrA from three groups of rats.A, B: on the right FrA; C, D: on the left FrA.#P<0.05，##P<0.01vsheroin-induced CPP group (St).

圖43組大鼠黑白箱停留和穿梭時FrA區遙測腦電波百分比分析

Figure 5. Percentage analysis of telemetry EEG recorded on FrA from the two groups of rats shuttling between two chambers. A: on the right FrA and between black-white chambers; B: on the right FrA and between white-black chambers; C: on the left FrA and between black-white chambers; D: on the left FrA and between white-black chambers.#P<0.05，##P<0.01vscontrol group.

圖5對照組和海洛因誘導位置偏愛組大鼠穿梭時FrA區遙測腦電波百分比分析

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EEGchangesoffrontassociationcortexinheroin-inducedCPPratsdetectedbywirelesstelemetry

PAN Qun-wan1, HUANG Lei2, ZHU Zai-man1, LI Min1, LI Jing1, ZHOU Hong-ming1

(1DepartmentofPhysiology,2DepartmentofAnesthesiologyandImageEquipment,WannanMedicalCollege,Wuhu241000,China.E-mail:panqunw@163.com)

AIM: To analyze the relationship between the electroencephalogram (EEG) changes of front association cortex (FrA) and the drug-seeking behavior by recording FrA EEG in heroin-induced conditioned place preference (CPP) rats.METHODSA CPP video system combined with the technique of EEG wireless telemetry was used in the study. The rats were randomly divided into control group and heroin-induced CPP group after stereotaxic electrodes were buried on in the FrA, and the latter group was used as heroin dependence model. The FrA EEG was recorded by wireless telemetry,including staying in black or white chamber of video box, black-white chamber shuttle and white-black chamber shuttle. The differences of EEG were analyzed by the relative power and the percentage of each wave.RESULTSWhen the rats stayed in the black or white chamber, no significant difference in the relative power and percentage of the telemetry EEG wave was observed (P>0.05). When the heroin-induced CPP rats shuttled between two chambers, especially shuttled between the black-white chambers, EEG on the left FrA showed that δ wave was reduced, and β wave together with β2wave was increased (P<0.05,P<0.01), while the EEG in control group showed the radically opposite changes.CONCLUSIONThe specific changes of EEG on the left FrA including reduction in slow wave and increase in fast wave may be related to drug-seeking behavior and motivation in the rat withdrawal status.

Heroin; Conditioned place preference; Front association cortex

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.010