Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用*

李海英， 張 力， 潘歡樂， 方 雅， 吳建波

(溫州醫學院附屬第一醫院，浙江 溫州 325000)

1000-4718(2012)09-1623-04

2012-04-07

2012-08-08

浙江省自然科學基金資助項目(No.LQ12H16005)

△ 通訊作者 Tel: 0577-88069372; E-mail: 21182907@qq.com

Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用*

李海英， 張 力△， 潘歡樂， 方 雅， 吳建波

(溫州醫學院附屬第一醫院，浙江 溫州 325000)

目的研究Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用。方法采用real-time RT-PCR檢測Wnt通路mRNA的表達；Western blotting和免疫熒光檢測Wnt通路蛋白的表達；動物成瘤實驗比較細胞在體內的增殖和成瘤能力。結果Wnt1表達上調引起Wnt通路激活，繼而引起下游一系列的基因表達改變；β-連環蛋白(β-catenin)在細胞內蓄積，并向核內轉移，調控的下游蛋白細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和WISP1表達量增多；放射抗拒性的食管癌細胞在小鼠體內表現出更強的增殖和成瘤能力。結論Wnt信號通路引起的細胞增殖加速可能是食管癌細胞放射抗拒性形成的重要原因。

Wnt信號通路； 食管腫廇； 放射抗拒性

放射治療是早期食管癌的首選治療手段，但是，就像其它上皮癌細胞一樣，食管癌細胞對電離輻射僅僅中度敏感。大約50%的病人在同步放化療后出現局部復發，輻射劑量增加導致毒性增加而治療效果卻沒有改善[1-2]。食管癌在放療后經常以小病灶的形式復發或進展，提示有一部分腫瘤細胞能再生長或存在放射抗拒性。本課題組先前已經報告了食管癌細胞株在分次照射后與其親代比放射抗拒性增強，同時證明分次照射建立的放射抗拒性食管癌細胞株表現出腫瘤干細胞樣特征[3]。我們又利用Agilent 4×44k全基因芯片對食管癌細胞原株和放射抗拒株的基因表達進行分析，發現Wnt(wingless-type MMTV integration site family)通路上有多個基因表達出現差異[4]，因此推測Wnt信號通路與放射抗拒性的形成有關。本實驗旨在研究Wnt信號通路在食管癌細胞放射抗拒性形成中的作用。

材 料 和 方 法

1試劑

β-連環蛋白(β-catenin)、GAPDH和Wnt1誘導信號通路蛋白1(Wnt1 inducible signaling pathway protein 1,WISP1)單抗購自Santa Cruz，糖原合成酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)、p-GSK3β(pS9)和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體購自Epitomics，p-β-catenin(Ser33/37/Thr41)抗體購自Cell Signaling Technology，熒光FITC標記Ⅱ抗購自Santa Cruz。

2方法

2.1細胞培養 人食管鱗癌細胞株KYSE-150購自JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources),放射抗拒性細胞株KYSE-150R為本室自建。細胞株貼壁培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,置37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養,0.25%胰酶(內含0.02%EDTA)消化傳代。

2.2Real-time RT-PCR 我們選擇了Wnt通路上的多個基因表達進行real-time RT-PCR，設計引物見表1,內參照為GAPDH。首先用Trizol分別從KYSE-150和KYSE-150R細胞中提取總RNA，然后用逆轉錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)合成cDNA，采用ABI7500熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料摻入法相對定量，以內參照為對照，計算差異表達的倍數。實驗重復3次。

表1 引物序列

2.3Western blotting 將指數生長期的KYSE-150和KYSE-150R細胞用一次性刮刀輕輕刮下，按200 μL∶106細胞的比例加入蛋白抽提試劑(M-PER mammalian protein extraction reagent, Thermo scientific)提取蛋白，采用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒做蛋白定量，每孔上樣50 μg進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉膜1 h，轉膜后5%牛奶封閉2 h，Ⅰ抗孵育4 ℃過夜，0.1%TBST洗3次，每次10 min，Ⅱ抗孵育1 h，再0.1%TBST洗3次，每次10 min，ECL曝光，膠片用Gel-Pro 3.1軟件分析。實驗重復3次。

2.4免疫熒光 將KYSE-150和KYSE-150R細胞做細胞爬片，甲醇固定15min，3%BSA封閉30 min，Ⅰ抗(1∶50)4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次10 min，Ⅱ抗(1∶100)避光孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI復染10 min，封片，熒光顯微鏡鏡檢。

2.5動物成瘤實驗 為了驗證KYSE-150和KYSE-150R細胞在動物體內的成瘤能力，我們將KYSE-150和KYSE-150R細胞數調整到1×105于NOD/SCID小鼠腋下進行皮下注射，4周后，解剖小鼠取出腫塊，測量其長寬，并根據公式體積(V)=長×寬2×0.5計算腫瘤大小。

3統計學處理

結 果

1Real-timeRT-PCR結果

KYSE-150R細胞中的Wnt1表達上調，是KYSE-150細胞的(3.48±0.17)倍，β-catenin上調(1.37±0.15)倍，Wnt4下調(0.56±0.11)倍，WISP1上調(1.95±0.14)倍，GSK3β上調(1.19±0.23)倍，cyclin D1上調(1.60±0.15)倍，見圖1。

2Westernblotting結果

KYSE-150R細胞中p-β-catenin表達減少，p-GSK3β、β-catenin、WISP1與cyclin D1表達增多，見圖2。我們推測Wnt通路激活使得p-β-catenin減少，非磷酸化β-catenin出現蓄積，引起下游產物cyclin D1和WISP1的表達增多。

3免疫熒光結果

免疫熒光的結果也證明了KYSE-150R細胞中β-catenin表達量明顯增多，并向核內聚集，見圖3。

4動物成瘤實驗

4周后KYSE-150R細胞長成明顯的團塊而KYSE-150細胞只在部分小鼠中長出小結節，見圖4，其瘤體體積分別為(1 325.11±259.22)mm3和(132.67±10.52)mm3(P<0.01)，表明放射抗拒性食管癌細胞KYSE-150R表現出更強的增殖和成瘤能力。

圖1Wnt通路中的信號分子mRNA表達情況

圖2Wnt通路中的信號分子蛋白的表達

Figure 3. β-catenin expression in KYSE-150 and KYSE-150R cells (×1 000).

圖3KYSE-150和KYSE-150R細胞中β-catenin的表達

Figure 4. The tumorigenicity of KYSE-150 and KYSE-150R cells.

圖4KYSE-150和KYSE-150R細胞在小鼠體內的成瘤結果

討 論

食管癌即使病理分型相同，其放射敏感性也并不相同[5]，食管癌細胞的放射抗拒性阻止了治療效率的提高。大部分的腫瘤科醫生將放射抗拒性歸因于腫瘤干細胞[6]。目前腫瘤干細胞的來源并不清楚，但資料顯示可能來源于干細胞，祖細胞或其它腫瘤細胞[7]，靶向腫瘤干細胞和大部份腫瘤細胞的治療可能抑制腫瘤的再生。

Wnt通路是一條十分保守的信號轉導通路，從低等生物果蠅直至高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性。國外學者認為Wnt信號通路與調控基因表達、細胞行為、細胞黏附和細胞極性有關[8]，在腫瘤干細胞的維持中也起著重要的作用[9]。目前認為Wnt通路的組成主要包括：細胞外因子(Wnt)、跨膜受體(Frizzled)、胞質蛋白(β-catenin)及核內轉錄因子(transcription factor,TCF)等一系列蛋白，其調控下游的一系列靶基因包括：c-Myc、cyclin D1、WISP1、基質金屬肽酶7(matrix metallopeptidase 7,MMP-7)、轉錄因子1(transcription factor 1，TCF-1)、CD44等。在經典的Wnt通路中β-catenin處于中心地位。在正常情況下，Wnt基本處于失活狀態，酪蛋白激酶1α和GSK3β依次磷酸化β-catenin，p-β-catenin被蛋白酶體降解，使胞質中的β-catenin始終維持較低的濃度。當Wnt通路激活時，β-catenin的磷酸化被抑制，β-catenin得以不斷積蓄，并進入細胞核與TCF結合，啟動下游基因轉錄。Mcmanus等也發現GSK3β S9可以被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, Akt)或其它蛋白激酶磷酸化,其來源多為其它生長因子信號通路(如IGF)。GSK3β S9磷酸化可以使GSK3β失活，從而不能持續磷酸化β-catenin, 使β-catenin可以積聚并得以繼續激活下游信號[10]。

我們在前期研究中利用Agilent 4×44k全基因芯片對食管癌放射抗拒性細胞株及其親本細胞進行比較，發現Wnt通路上有多達19個基因出現表達差異[4]。我們用real-time RT-PCR對其進行了驗證，發現Wnt1、β-catenin、WISP1、GSK3β和cyclin D1表達上調，Wnt4表達下調，說明Wnt通路的激活可能是Wnt1表達上調引起，繼而引起下游一系列基因的改變。我們又對Wnt通路上蛋白的表達進行了研究，發現Wnt通路的激活使得GSK3β S9位點磷酸化，繼而引起磷酸化的β-catenin減少，非磷酸化β-catenin出現蓄積，導致下游產物cyclin D1和WISP1的表達增多。免疫熒光的結果也證明了KYSE-150R細胞中β-catenin明顯增多，并向核內聚集。

Cyclin D1是細胞周期的正調節因子，cyclin D1蛋白過表達可以加速細胞G1期向S期轉化，促使細胞增殖，使細胞處于不斷增殖的類似前體細胞的狀態。WISP1具有促進細胞增殖、介導細胞黏附、刺激細胞轉移、促進有絲分裂及細胞外基質的形成等生物學功能。WISP1的表達水平與多種組織惡性腫瘤的發生、進展、侵襲、轉移及其預后有著密切的聯系。在放射抗拒性細胞KYSE-150R細胞中，β-catenin蛋白增多，引起其調控的下游蛋白cyclin D1和WISP1表達增多，使得KYSE-150R細胞表現出更強的增殖能力，我們的動物實驗也證實了這一點。我們因此推測cyclin D1和WISP1引起的細胞加速增殖可能是KYSE-150R細胞獲得放射抗拒性的重要原因。

綜上所述，我們認為Wnt通路在食管癌放射抗拒性的獲得中有重要作用，Wnt通路激活導致β-catenin蛋白的蓄積，引起下游cyclin D1和WISP1的表達升高，細胞增殖加速，可能是KYSE-150R細胞表現出放射抗拒性的重要原因。下一步，我們將研究抑制Wnt通路對食管癌細胞放射抗拒性的影響。

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RoleofWntsignalingpathwayindevelopmentofradioresistanceinesophagealcancer

LI Hai-ying, ZHANG Li, PAN Huan-le, FANG Ya, WU Jian-bo

(TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail: 21182907@qq.com)

AIM: To investigate the role of Wnt signaling pathway in the development of radioresistance in esophageal cancer cells.METHODSThe mRNA expression of the genes involved in Wnt signaling pathway was determined by real-time RT-PCR. The protein levels involved in Wnt signaling pathway were also confirmed by Western blotting and immunofluorescence method. Xenograft assay was performed to compare the proliferation ability and tumorigenicity of the cell lines.RESULTSUp-regulation of Wnt1 induced the activation of Wnt signaling pathway and the variation of the downstream genes. β-catenin was accumulated and nuclear-transferred. The expression of downstream targeted genes such as cyclin D1 and WISP1 was increased. The radioresistant esophageal cancer cells showed higher proliferation ability and tumorigenicity in nude mouse xenograft.CONCLUSIONWnt signaling-induced acceleration of proliferation is important for the development of radioresistance in esophageal cancer cells.

Wnt signaling pathway; Esophageal neoplasms; Radioresistance

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.015