細胞鈣離子轉運蛋白蘭尼堿受體3與ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的關系*

馮利霞， 葛長江△， 呂樹錚， 孫海梅， 季鳳清， 霍 勇

(1首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心內科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，北京100069；3北京大學第一醫(yī)院心內科，北京100034)

1000-4718(2012)09-1686-04

2012-03-29

2012-07-11

國家“十一五”科技支撐計劃(No.2006BAI01A02)；首都醫(yī)學科技發(fā)展基金資助項目(No.SF-2009-I-09)；首都醫(yī)科大學基礎與臨床合作基金課題(No.11JL51)

△通訊作者 Tel:010-64456473;E-mail：cjge1116@163.com

·短篇論著·

細胞鈣離子轉運蛋白蘭尼堿受體3與ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的關系*

馮利霞1， 葛長江1△， 呂樹錚1， 孫海梅2， 季鳳清2， 霍 勇3

(1首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心內科，北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，北京100069；3北京大學第一醫(yī)院心內科，北京100034)

目的觀察細胞鈣離子轉運蛋白蘭尼堿受體3(ryanodine receptor 3, RYR3)在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的改變，探討兩者的相關性。方法選取6周齡雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠及野生型C57BL/6J小鼠，高脂飼喂20、27和33周后,在各個時點處死動物取主動脈根部制作連續(xù)切片。(1)HE染色，觀察組織形態(tài)學的變化，計算機圖像分析儀測量斑塊面積和血管管腔面積，計算校正斑塊面積(斑塊面積/血管管腔面積)。(2)免疫組織化學染色，計算機圖像分析儀測定不同周齡小鼠細胞鈣離子轉運蛋白RYR3表達變化。結果與同周齡對照組小鼠相比，ApoE-/-小鼠體內RYR3表達顯著減少(P<0.05)，隨著ApoE-/-小鼠周齡的增加，RYR3的表達明顯減少，且與斑塊面積/血管管腔面積呈負相關(r=-0.652，P<0.01)。結論細胞鈣離子轉運蛋白RYR3參與動脈粥樣硬化的病理過程，且與動脈粥樣硬化斑塊的形成密切相關。

蘭尼堿受體3；載脂蛋白E；動脈粥樣硬化

作為冠心病的重要始動因素，動脈粥樣硬化是以血管內皮損傷為基礎的多種危險因素綜合作用的結果，主要包括血管重塑和易損斑塊形成。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖與凋亡是決定動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。已知Ca2+參與細胞增殖和凋亡的過程，而Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持則受細胞離子泵的調控。細胞離子通道的開通和激活與動脈粥樣硬化性血管疾病密切相關[1-2]。Van Assche等[3]研究發(fā)現，在動脈粥樣硬化斑塊形成之前，ApoE-/-小鼠主動脈VSMCs內基礎Ca2+水平增高，1, 4, 5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)含量及其介導的Ca2+釋放均明顯增高，而蘭尼堿受體(ryanodine receptor, RYR)含量卻未見明顯改變，然而尚不明確動脈粥樣硬化斑塊長期形成過程中該蛋白的動態(tài)表達變化規(guī)律及其間的關系。本研究應用載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene-deficient,ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化模型，觀察在動脈粥樣硬化病程中，主動脈VSMCs內RYR3表達的改變，并明確其與動脈粥樣硬化斑塊之間的關系。

材 料 和 方 法

1動物和試劑

6周齡ApoE-/-(品系C57BL/6J,北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部自美國Jackson實驗室引進并培育)15只，質量合格證號[SCXK(京)2006-0008],野生型C57BL/6J小鼠由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，質量合格證號[SCXK(京)2007-004]。均為雄性,體重18～20 g,飼養(yǎng)條件為2級,室溫保持在22～24 ℃,相對濕度50%,光照時間7:00～19:00。RYR3Ⅰ抗購自Chemicon，Ⅱ抗、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2動物分組和模型制備

選取15只6周齡ApoE-/-為模型組，野生型C57BL/6J小鼠為對照組，分別給予高脂飼料(基礎飼料78.85%，脂肪21%，膽固醇0.15%)，喂養(yǎng)20周、27周和33周(每組5只)。在各個時點處死動物后取主動脈根部用 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋制備連續(xù)切片。

3方法

3.1標本處理 20周齡、27周齡、33周齡時隨機各取5只處死動物，處死前1 d晚上禁食不禁水。無菌條件下取出心臟和主動脈,10%甲醛固定,脫水,常規(guī)石蠟包埋,小鼠心底部橫斷面連續(xù)切片。每只小鼠的主動脈根部取4個相同的切面[4-5],分別是：(1)升主動脈最近端橫截面,切面形態(tài)呈圓形；(2)主動脈瓣附著部位,并有冠狀動脈開口；(3)主動脈瓣起始橫截面；(4)主動脈瓣完全出現并匯合在一起。每隔100 μm連續(xù)取6張切片,切片厚5 μm,相鄰的2個切面分別進行HE染色及免疫組織化學染色。

3.2斑塊面積的測定 HE染色，形態(tài)計量學測定斑塊面積、血管管腔面積(取4個切面平均值)，計算矯正的斑塊面積(斑塊面積/血管管腔面積)。

3.3免疫組織化學染色法測定RYR3蛋白含量 取主動脈根部10%甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋，制成厚5 μm組織切片，置于APES防脫玻片上60 ℃烤片固定，脫蠟、水化，3% H2O2封閉內源性過氧化氫酶5～10 min，蒸餾水洗3次，微波修復抗原檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)92～98℃,15 min；自然冷卻，PBS洗3次，滴加1∶500的兔抗小鼠RYR3Ⅰ抗(含1%牛血清)4 ℃孵育24 h，PBS洗3次后，HRP標記的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育30 min，滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色變化，約60 s后自來水終止反應。蒸餾水洗，蘇木精復染2 min，蒸餾水洗5 min，自來水返藍，后脫水、透明、封片、鏡檢。實驗均設陽性對照與陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照，用PBS緩沖液代替Ⅰ抗作陰性對照。結果的判定：光鏡下，陽性表達RYR3的細胞，胞漿呈黃至棕黃色，RYR3定位于胞漿。定量分析：×200下Leica Q 5501W圖像處理顯微鏡進行圖像分析，測定RYR3蛋白的積分吸光度值，取4個切面的平均值。

4統(tǒng)計學處理

結 果

1不同周齡小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的病理結構變化

20周齡ApoE-/-小鼠有纖維斑塊形成，此時尚有比較完整的纖維帽,內含小的脂質中心和少量泡沫細胞,纖維帽主要由VSMCs、彈力纖維和較多的膠原纖維組成。27周齡ApoE-/-小鼠有粥樣斑塊形成，泡沫細胞堆積，纖維帽變薄，且含有更多的彈力纖維及膠原纖維，部分破裂。33周齡ApoE-/-小鼠粥樣斑塊進展明顯,大量泡沫細胞崩解,深部為大量無定形壞死物質,斑塊破裂、管腔狹窄明顯,嚴重者達70%～90%。對照組C57BL/6J各周齡小鼠未見斑塊的形成，中層VSMCs也未發(fā)生明顯變化，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of atherosclerotic plaques in the aorta ofApoE-/-mice (HE staining, ×200). C57BL/6J mice served as controls.

圖1ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的病理變化

2不同周齡ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊面積的測定

從20周齡至33周齡動態(tài)連續(xù)觀測結果看,隨時間延長,ApoE-/-小鼠的斑塊面積大小及校正斑塊面積的比值呈增長趨勢,說明斑塊增長與時間呈正比，見表1。

表1ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊面積

GroupPlaquearea(mm2)Lumenarea(mm2)Plaquearea/lumenarea20-weekmodel0．035±0．0040．411±0．0110．086±0．00927-weekmodel0．076±0．0040．462±0．0190．164±0．009?33-weekmodel0．132±0．0180．409±0．0320．323±0．037?△

*P<0.05vs20-week model group;△P<0.05vs27-week model group.

3RYR3免疫組化染色測定

與同周齡C57BL/6J小鼠比較，細胞鈣離子轉運蛋白RYR3在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中的表達明顯降低(P<0.05)，隨著ApoE-/-小鼠周齡的增加， RYR3活性和表達明顯降低(P<0.05)，見圖2、表2。

4RYR3含量與斑塊面積之間的相關性

隨著周齡的增加，RYR3表達與斑塊面積/管腔面積呈負相關(r=-0.652，P<0.01)。

Figure 2. Expression of ryanodine receptor 3 (RYR3) in the aorta of C57BL/6J mice (control group) andApoE-/-mice (model group) (immunohistochemical staining, ×200). Red arrows indicate vascular smooth muscle cells expressing RYR3.

圖2RYR3在小鼠主動脈中的表達

表2RYR3免疫組化染色積分吸光度值

GroupRyanodinereceptor320-weekmodel0．182±0．007#27-weekmodel0．162±0．003?#33-weekmodel0．142±0．004?△#20-weekcontrol0．193±0．00527-weekcontrol0．192±0．00333-weekcontrol0．189±0．002

*P<0.05vs20-week model group;△P<0.05vs27-week model group;#P<0.05vscontrol group at the same age.

討 論

動脈粥樣硬化斑塊形成以內皮功能紊亂為病理學特征，主要涉及多種危險因子對血管內皮損傷、源于血管平滑肌細胞和巨噬細胞的泡沫細胞沉著入內皮間隙以及血管平滑肌細胞增殖遷移等，終致纖維脂質斑塊形成。盡管動脈粥樣硬化斑塊的大小決定組織缺血的程度，然而決定動脈粥樣硬化最終結局的卻是斑塊的“行為”。動脈粥樣硬化斑塊的組成決定其臨床意義。與穩(wěn)定斑塊相比，不穩(wěn)定斑塊(易于破裂)包含著較高比例的炎癥細胞及脂質和較低比例的VSMCs組成的纖維帽，這些薄纖維帽斑塊的破裂是產生致命性心臟猝死最常見的原因[6]。因此VSMCs是動脈粥樣硬化斑塊中最重要的細胞成分之一，在動脈粥樣硬化病程中一旦變化將推動其發(fā)生發(fā)展。

VSMCs是組成血管壁的主要細胞之一，具有非常強的可塑性，能在靜止的分化表型和增殖表型之間轉化，Ca2+在這種改變中發(fā)揮著重要作用。細胞內Ca2+濃度受細胞膜和肌質網(sarcoplasmic reticulum,SR)膜上的Ca2+通道所調控。細胞內Ca2+主要貯存于肌質網內，貯存Ca2+的釋放由RYR及IP3R介導，釋放于肌漿內的Ca2+在SR Ca2+-ATP酶(SR Ca2+-ATPase, SERCA)的調控下逆濃度差攝入SR。這樣一來，由IP3及RYR引起的Ca2+釋放最終導致細胞內Ca2+庫耗竭。細胞內和肌質網內一定濃度的游離狀態(tài)Ca2+對于維持VSMCs的增殖和分化至關重要。游離Ca2+濃度增高促進細胞增殖，但過度增高甚至肌質網儲存Ca2+排盡可造成細胞凋亡。在動脈粥樣硬化早期，凋亡頻率非常低，在晚期達到高峰，伴隨著VSMCs和巨噬細胞展示凋亡的特性[7-8]，提示VSMCs凋亡可能通過削弱纖維帽來促進斑塊破裂。

RYR是位于肌質網膜上的Ca2+釋放通道，對細胞內Ca2+濃度非常敏感：1～10 μmol/L Ca2+濃度使通道激活，大于10 μmol/L Ca2+濃度抑制通道的激活[9]。截止目前，發(fā)現 RYR通道有3種亞型：RYR1、RYR2和RYR3。RYR存在于幾乎所有的肌細胞類型，RYR1主要引起骨骼肌興奮，RYR2實現心肌收縮，已證實小鼠VSMCs主要表達RYR3亞型[10]。當Ca2+通過L型Ca2+通道進入細胞膜時，激活肌質網上的IP3R、RYR1和RYR2，Ca2+從肌質網流向細胞質，即鈣觸發(fā)鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release, CICR)。當細胞內的Ca2+濃度達到一定水平時，肌質網上的靠近細胞膜的RYR3被激活，進一步激活該處細胞膜上的K+通道，引起自發(fā)性短暫性外向性電流(spontaneous transient outward currents,STOCs)的產生，調節(jié)細胞膜電位，使膜復極化，進而使通過細胞膜進入細胞的Ca2+減少[11-12]。

本研究表明，隨著時間的延長，ApoE-/-小鼠模型中的動脈粥樣硬化斑塊經歷從脂紋、纖維斑塊至粥樣斑塊的不同時期，且不僅局限于主動脈根部，在冠狀動脈、主動脈弓及其分叉處、頸總動脈及其分叉處、胸主動脈、腹主動脈、雙腎動脈分叉處均可形成斑塊，與人類全身動脈粥樣硬化斑塊形成的過程及好發(fā)部位相近[13]，說明ApoE-/-小鼠是研究動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的可靠模型；且斑塊的組成也發(fā)生了明顯變化，由較低比例的炎癥細胞、脂質和較厚的纖維帽，逐漸轉變?yōu)楦弑壤难装Y細胞、脂質和較薄的纖維帽。隨著周齡的增加，斑塊面積也逐漸增加。而對照組C57BL/6J小鼠發(fā)展至脂紋期后幾乎就不再進一步發(fā)展，且病變大部分局限于主動脈竇部。

且從20周齡～33周齡動態(tài)連續(xù)觀測結果看,20周齡時ApoE-/-小鼠RYR3功能開始受損，隨著時間延長，其活性逐漸減弱，且與校正斑塊面積呈負相關。年幼小鼠體內氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)的水平不足以引起RYR功能的改變，然而慢性低水平的 ox-LDL卻削弱了RYR功能的發(fā)揮。這與目前的研究結論一致[3, 14-15]。可能的解釋是RYR3的丟失使VSMCs不能發(fā)揮終止RYR1,2介導的CICR[11]，使細胞內Ca2+濃度持續(xù)增加。細胞內Ca2+輕度增加可以促進增殖，但過度增高甚至肌質網儲存Ca2+排盡可造成細胞凋亡。在動脈粥樣硬化斑塊形成的晚期確實見到VSMCs的大量凋亡，由此推測，RYR3與VSMCs凋亡密切相關，且與動脈粥樣硬化斑塊形成密切相關。

未來研究將進一步闡述VSMCs凋亡過程中其它一些鈣離子通道的功能改變及其與RYR3之間的相互關系,及用特異性作用于這些鈣離子通道的藥物進行干預，以期動態(tài)觀察細胞鈣離子轉運蛋白活性的改變及其與動脈粥樣硬化斑塊不良預后的確切關系。

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Relationshipbetweencellcalciumiontransporterryanodinereceptor3andatheroscleroticplaqueinapolipoproteinEgene-deficientmice

FENG Li-xia1, GE Chang-jiang1, Lü Shu-zheng1, SUN Hai-mei2, JI Feng-qing2, HUO Yong3

(1DepartmentofCardiology,BeijingAnzhenHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingInstituteofHeart,LungandBloodVesselDiseases,Beijing100029,China;2DepartmentofHistology&Embryology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;3DepartmentofCardiology,theFirstHospital,BeijingUniversity,Beijing100034,China.E-mail:cjge1116@163.com)

AIM: To investigate the change of cell calcium ion transporter ryanodine receptor 3 (RYR3) in the aorta smooth muscle cells of apolipoprotein E gene-deficient (ApoE-/-) mice, and to elucidate the relationship between RYR3 and atherosclerotic plaque inApoE-/-mice.METHODSSix-week-oldApoE-/-mice and wild-type C57BL/6J mice were used in the experiment. The animals were sacrificed for pathological observation at the time points of 20, 27 and 33 weeks after hyperlipidic diet, respectively. Four sections of the aortic root were prepared and HE and immunohistochemical staining were performed. All the sections were analyzed with a computer image analysis system.RESULTSCompared with the controls, the expression of RYR3 was markedly lower inApoE-/-mice (P<0.05). As the age ofApoE-/-mice increasing, the expression of RYR3 decreased significantly, and was negatively correlated to the plaque area corrected by lumen area (r=-0.652,P<0.01).CONCLUSIONCell calcium ion transporter RYR3 participates in the pathological process of atherosclerosis, and is closely related to the formation of atherosclerotic plaques.

Ryanodine receptor 3; Apolipoprotein E; Atherosclerosis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.026