洛伐他汀誘導人子宮內膜癌JEC細胞G1期同步化的研究*

沈慧敏， 李小毛， 楊越波， 王小韻

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

1000-4718(2012)05-0791-05

2011-12-08

2012-03-15

國家自然科學基金資助項目(No. 30772332)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 7001568)；廣東省科技計劃(No.2011B031800056)

△通訊作者 Tel: 020-85252259; E-mail: tigerlee777@163.com

洛伐他汀誘導人子宮內膜癌JEC細胞G1期同步化的研究*

沈慧敏， 李小毛△， 楊越波， 王小韻

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

目的探討洛伐他汀(Lov)誘導人子宮內膜癌JEC細胞G1期同步化的方法及JEC細胞解除G1期同步化后的細胞周期進程。方法CCK-8法測定JEC細胞的倍增時間，采用10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L的Lov，作用1×細胞倍增時間進行流式細胞術檢測G1期細胞的比例，獲得G1期同步化的最佳Lov濃度；采用最佳濃度作用JEC細胞，于作用后的0.5×倍增時間～2×倍增時間內，每隔4 h檢測同步化程度，獲得最佳濃度Lov作用下的最佳同步化時間；解除G1期同步化，每隔4 h檢測一次，研究JEC細胞解除G1期同步化后的細胞周期進程。結果CCK-8法檢測顯示JEC細胞的倍增時間約為24 h；JEC細胞的最佳G1期同步化條件為：20 μmol/L Lov作用24 h，可獲取G1期細胞(85.00±0.79)%；JEC細胞于解除G1期同步化后16 h，獲得最大量的S期細胞，為(45.28±0.53)%；同時G1期細胞比例達到最低，為(35.93±0.44)%。結論20 μmol/L Lov作用24 h，可獲得大量G1期細胞；解除G1期同步化后16 h，S期細胞比例最高，G1期細胞比例達到最低，達到滿意的G1期同步化釋放后效果。

洛伐他汀； JEC細胞； 細胞周期； G1期同步化

腫瘤被認為是一類細胞周期性疾病[1-2]，腫瘤發生的本質可能是細胞周期調節失控，細胞呈自主、不受控、無限制增殖。腫瘤細胞周期的研究是目前腫瘤分子生物學研究中的熱點。在進行細胞周期研究時通常需要使用細胞同步化的方法獲得大量處于同一細胞周期時相的細胞。而根據研究需要細胞群所處細胞周期時相的不同，細胞同步化又分為G0/G1期同步化、G1期同步化、G2期同步化、M期同步化和S期同步化。各細胞周期時相同步化又有多種方法可供選擇，如需將細胞同步化于G0/G1期，可采用血清饑餓法、氨基酸饑餓法；如需將細胞同步化于G1期，多采用洛伐他汀(lovastatin,Lov)或含羞草堿誘導等方法；如需將細胞同步化于S期，多采用胸腺嘧啶核苷阻滯法。

目前，國內外對子宮內膜癌細胞的同步化研究尚不多見，本研究以人子宮內膜癌細胞系JEC細胞為實驗細胞株，探討Lov誘導JEC細胞G1期同步化的效率及獲取最佳G1期同步化效果的洛伐他汀作用濃度和作用時間，并進一步探討JEC細胞解除G1期同步化后的細胞周期進程，為研究子宮內膜癌發生發展中的細胞周期調控機制提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1材料

人子宮內膜癌細胞JEC為本室保存。細胞培養基低糖DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)均為Gibco產品。胰酶為吉諾生物產品。洛伐他汀、甲羥戊酸(mevalonic acid, MVA)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)和核糖核酸酶A (ribonuclease A, RNase A)均為Sigma產品。Cell Counting Kit-8(CCK-8)為同仁化學研究所產品。FACSCalibur流式細胞儀為Becton Dickinson產品。

2方法

2.1細胞培養 人子宮內膜癌細胞JEC為貼壁生長細胞，接種于含10% FBS的低糖DMEM培養基中，37℃、5% CO2恒溫培養箱培養。

2.2CCK-8法測細胞倍增時間 取培養的JEC細胞進行消化、離心、重懸、計數。以含10% FBS的低糖DMEM為培養基，按每孔3 000個細胞接種到96孔細胞培養板，分6組，每組設5個復孔。接種后將96孔板置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱培養。在接種后經培養24 h(計為基點0 h)、40 h(計為16 h)，之后每隔2～4 h加入CCK-8，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱孵育2 h后上酶標儀檢測吸光度(A)值(檢測波長：490 nm；參比波長：630 nm)，并依據測得的A值調整檢測時間間隔，直至A值升至基點時A值的2倍，此時的時間間隔即為該細胞的倍增時間。

2.3Lov誘導G1期同步化處理 參照文獻[3]Lov誘導細胞G1期同步化方法，稍加改進，具體操作步驟如下：取培養的JEC細胞進行消化、離心、重懸、計數，以含10% FBS的低糖DMEM為培養基，按每孔5×105個細胞接種到6孔細胞培養板，分為4組，每組設3個復孔，接種后將6孔板置于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養24 h，4組細胞分別給予10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用1×細胞倍增時間，收集細胞進行流式分析細胞周期情況，選取將JEC細胞同步于G1期百分比最高的Lov濃度，即為G1期同步化最佳Lov濃度；再按上述步驟接種JEC細胞于6孔板中，每組設3個復孔，均加入上述最佳G1期同步化濃度的Lov于培養基中，作用0.5×細胞倍增時間～2×細胞倍增時間，每隔4 h收集細胞進行流式檢測分析細胞周期情況，選取在最佳Lov濃度下，將細胞同步于G1期百分比最高的作用時間，即為最佳Lov濃度下G1期同步化的最佳時間。

2.4解除G1期同步化處理 按方法2.3所述步驟接種JEC細胞于6孔板中，每組設3個復孔，均加入上述最佳G1期同步化濃度的Lov于培養基中作用最佳時間后，吸棄上述含Lov的培養液，PBS洗3次，再加入含MVA(濃度為100倍上述最佳Lov濃度)的培養基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱培養≥1×細胞倍增時間，每隔4 h收集細胞進行流式檢測細胞周期。

2.5流式細胞儀檢測細胞周期 0.25%胰酶消化細胞，收集于離心管中，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心4 min，棄上清液，加入70%乙醇1 mL，懸浮細胞，固定過夜，檢測時1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入0.5% RNase A 50 μL，混勻，加入450 μL PI染液，避光處2～8 ℃放置30 min，上流式細胞儀檢測。

3統計學處理

結 果

1CCK-8法測JEC細胞倍增時間

JEC細胞經培養0 h(即基點)、16 h、20 h、22 h、24 h和28 h后，其A值分別為：0.3778、0.5829、0.6670、0.6970、0.7423和0.7691。24 h的A值較基點A值增長了1倍，提示JEC細胞的倍增時間約為24 h。

2Lov誘導JEC細胞G1期同步化

2.1G1期同步化最佳Lov濃度 4組JEC細胞分別經10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用24 h后，G1期細胞的比例分別為：(81.13±0.70)%、(85.00±0.79)%、(82.62±0.73)%和(82.93±0.56)%，見圖1、2。20 μmol/L Lov作用24 h組G1期細胞達到(85.00±0.79)%，較10 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L Lov作用24 h組為高，差異有統計學意義(P<0.05),提示Lov誘導JEC細胞G1期同步化的最佳濃度為20 μmol/L。

Figure 1. Effect of different concentrations of lovastatin (Lov) for 24 h on cell cycle of JEC cells. A: 10 μmol/L Lov;B: 20 μmol/L Lov;C: 30 μmol/L Lov；D: 40 μmol/L Lov.

圖1不同濃度洛伐他汀作用JEC細胞24h對細胞周期的影響

圖2不同濃度洛伐他汀作用JEC細胞24hG1期細胞的比例

2.2最佳Lov濃度下G1期同步化最佳作用時間 JEC細胞分為10組，每組均加入20 μmol/L Lov，作用12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h和48 h后G1期細胞的比例分別為：(70.43±1.21)%、(75.46±1.13)%、(82.45±1.09)%、(85.00±0.79)%、(83.02±0.44)%、(80.68±0.45)%、(67.60

±0.62)%、(55.57±0.53)%、(47.78±1.80)%、(50.39±2.12)%，見圖3、4。JEC細胞經20 μmol/L Lov作用24 h組達到G1期最大同步化，G1期細胞占(85.00±0.79)%，較20 μmol/L Lov作用12 h、16 h、20 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h和48 h組為高，差異有統計學意義(P<0.05),提示JEC細胞Lov誘導G1期同步化的最佳條件為：20 μmol/L Lov作用24 h。

3JEC細胞解除G1期同步化后細胞周期進程

JEC細胞分為8組，每組均采用20 μmol/L Lov同步化作用24 h后，再加入2 mmol/L MVA解除G1期同步化，結果顯示：JEC細胞解除G1期同步化后16 h G1期細胞占比達到最低，為(35.93±0.44)%，與其它7組(解除G1期同步化后4 h、8 h、12 h、20 h、24 h、28 h和32 h組)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；解除G1期同步化16 h后，S期細胞占比達到最高，為(45.28±0.53)%，與其它7組(解除G1期同步化后4 h、8 h、12 h、20 h、24 h、28 h和32 h組)比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1和圖5、6。

Figure 3. Effect of 20 μmol/L lovastatin for different durations on cell cycle of JEC cells. A: 12 h;B: 16 h;C: 20 h;D: 24 h;E: 28 h;F: 32 h;G: 36 h;H: 40 h;I: 44 h;J: 48 h.

圖320μmol/L洛伐他汀作用不同時間后對JEC細胞周期的影響

圖420μmol/L洛伐他汀作用JEC細胞不同時間后G1期細胞的比例

表1JEC細胞解除G1期同步化后細胞周期進程

GroupG1SG2/M4h76.09±0.5914.45±0.809.46±0.228h67.96±0.2617.57±0.3714.47±0.2212h51.46±1.2732.21±1.1416.33±0.3716h35.93±0.44*45.28±0.53*18.79±0.8720h37.62±0.9939.72±0.9722.66±0.8724h55.91±0.8922.89±0.7121.20±1.4128h72.83±1.6616.36±1.0610.81±1.4032h76.33±1.0017.73±2.145.94±1.15

*P<0.05vsother groups.

Figure 5. Cell cycle progress of JEC cells desynchronized for different durations after induced by 20 μmol/L lovastatin for 24 h.A: 4 h; B: 8 h; C: 12 h; D: 16 h; E: 20 h; F: 24 h; G: 28 h; H: 32 h.

圖520μmol/L洛伐他汀作用24h對JEC細胞解除G1期同步化的影響

圖620μmol/L洛伐他汀作用JEC細胞24h后釋放不同時間的細胞周期進程

討 論

洛伐他汀抑制HMG-CoA還原酶，導致甲羥戊酸缺乏，而甲羥戊酸是膽固醇合成的前體物質，也是p21和Ras的底物異戊烯化所必需的[4]。洛伐他汀能阻滯大部分貼壁細胞和懸浮細胞于G1早期且具有如下優點[3,5]：(1)洛伐他汀的同步化作用對細胞無毒性且可逆，通過加入甲羥戊酸即可消除其作用；(2)洛伐他汀同步化時由于不缺乏營養物質與生長因子，不會導致細胞代謝失衡；(3)可以獲取大量同步化的G1期細胞；(4)同步化效率與細胞種類、細胞接種密度、培養基的類型無關；(5)可以重復進行同步化。Wu等[6]研究發現用5 μmol/L洛伐他汀作用32 h可使CHO細胞獲得90%的G1期細胞；另有學者研究發現分別用10 μmol/L和20 μmol/L的洛伐他汀作用乳腺癌M6和MCF-1細胞24 h和33 h，可分別獲得78%和77%～96%的G1期細胞[7-8]；用10 μmol/L洛伐他汀分別作用24 h和24～48 h可使前列腺癌Pr14和PC-3-M細胞獲得82%和68%～90%的G1期細胞[7,9]；用30 μmol/L洛伐他汀干擾膀胱癌T-24細胞可獲得80% G1期細胞，對肺癌Calu-1細胞則可獲得70%～90%的G1期細胞[10-11]；還可作用于HL-60、T47D、HELA和U2-OS細胞，獲得較理想的G1期同步化效應[12-17]。在本實驗中使用洛伐他汀對子宮內膜癌JEC細胞進行G1期同步化，首先測定JEC細胞的倍增時間為24 h，符合進行細胞周期同步化的條件，參照Keyomarsi等[5]的洛伐他汀誘導細胞G1期同步化方法，改進如下：先測定JEC細胞G1期同步化的最佳洛伐他汀濃度，我們采用4個濃度梯度：10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L和40 μmol/L洛伐他汀，作用1×細胞倍增時間即24 h，發現JEC細胞獲得最大G1期同步化效率的洛伐他汀作用濃度為20 μmol/L，此時細胞G1期同步化的程度為(85.00±0.79)%，即為最佳G1期同步化濃度；接下來研究獲得最佳同步化的洛伐他汀作用時間，采用上述的最佳濃度作用于JEC細胞，于作用后的0.5×倍增時間～2×倍增時間內，每隔4 h檢測同步化程度，發現JEC細胞在上述最佳濃度洛伐他汀作用下的最佳同步化時間為24 h，此時G1期同步化的程度為(85.00±0.79)%，得到滿意的同步化效率，由此得出JEC細胞的最佳G1期同步化條件為：20 μmol/L Lov作用24 h。與文獻比較，本實驗采用洛伐他汀不同濃度梯度結合不同時間間隔取樣的同步化方法，更有利于精確地確定洛伐他汀對所研究細胞進行G1期同步化所能達到的最大效率。再對JEC細胞進行解除G1期同步化后細胞進程進行研究，發現JEC細胞于釋放后16 h，獲得最大量的S期細胞，為(45.28±0.53)%；同時G1期細胞比例達到最低，為(35.93±0.44)%，達到滿意的G1期同步化釋放后效果，可用于開展相關實驗研究。

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Lovastatin-inducedG1phasesynchronizationinhumanendometrialcancerJECcells

SHEN Hui-min, LI Xiao-mao, YANG Yue-bo, WANG Xiao-yun

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tigerlee777@163.com)

AIM: To investigate the method of inducing G1phase synchronization in human endometrial cancer JEC Cells by lovastatin and the cell cycle progress of JEC cells after desynchronization.METHODSThe doubling time of JEC cells was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. To determine the best lovastatin concentrations for G1synchronization, JEC cells were treated with lovastatin at concentrations of 10, 20, 30 and 40 μmol/L for 1× doubling time, and the cell cycle was detected using flow cytometry (FCM). To determine the best period of lovastatin treatment to achieve G1synchronization, JEC cells were treated with lovastatin at the best concentration for 0.5× to 2× doubling time, and the cell cycle was detected every 4 h using FCM. Furthermore, the cell cycle progress of JEC cells after desynchronization was also observed.RESULTSThe doubling time of JEC cells was almost 24 h. Treatment with lovastatin at the concentration of 20 μmol/L for 24 h achieved maximum G1arrest [(85.00±0.79)%]in JEC cells. Minimum G1phase [(35.93±0.44)%]and maximum S phase [(45.28±0.53)%] were observed after desynchronization for 16 h.CONCLUSIONMaximum G1synchronization of JEC cells is induced by lovastatin at the concentration of 20 μmol/L for 24 h. The JEC cells show minimum G1phase and maximum S phase after desynchronization for 16 h.

Lovastatin; JEC cells; Cell cycle; G1phase synchronization

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.004