結直腸癌原發灶中CXCR6的表達與臨床意義*

陳志輝， 宋新明， 李欣欣， 何裕隆

(中山大學附屬第一醫院胃腸胰外科，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0811-05

2012-02-21

2012-04-26

廣東省科技計劃項目(No.2011B031800118)

△通訊作者 Tel: 020-87755766; E-mail: bigo_sysu@163.com

結直腸癌原發灶中CXCR6的表達與臨床意義*

陳志輝， 宋新明△， 李欣欣， 何裕隆

(中山大學附屬第一醫院胃腸胰外科，廣東 廣州 510080)

目的明確趨化因子受體CXCR6在結直腸癌原發灶中的表達特點及臨床意義。方法收集2004年8月至2008年12月中山大學附屬第一醫院手術切除的143例結直腸癌標本及29例癌旁組織，應用免疫組化方法檢測CXCR6的表達，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片的平均累積吸光度(mIA)，分析CXCR6與同時性肝轉移及預后的關系。結果CXCR6在結直腸癌組織中呈不同程度的陽性表達，在癌旁正常組織中弱表達或不表達。結直腸癌原發灶中CXCR6的mIA在0.41～2.84之間，平均為1.54±0.04，其中同時性肝轉移病例為1.63±0.05，無肝轉移病例為1.41±0.08，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。以mIA值1.54為界，將病例劃分為CXCR6低表達組(mIA<1.54)和CXCR6高表達組(mIA≥1.54)。CXCR6高表達患者的總生存率顯著較低表達組差，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。多因素Cox回歸分析發現年齡(P<0.05)、淋巴結轉移(P<0.05)和同時性肝轉移(P<0.01)為結直腸癌患者預后的獨立危險因素，CXCR6為非獨立危險因素。CXCR6表達與IV期肝轉移患者預后無關(P>0.05)，與I～III期結直腸癌患者預后呈負相關(P<0.01)。結論CXCR6與結直腸癌肝轉移的發生相關，它有望成為結直腸癌肝轉移治療的一個重要靶點。

結直腸腫瘤； 趨化因子； CXCR6蛋白，人； 肝轉移； 預后

肝臟是結直腸癌最常見的轉移部位，據統計，確診時約15%～25%的結直腸癌患者出現同時性肝轉移，15%～20%接受根治性手術后發生異時性肝轉移[1]。

TNM分期及淋巴管浸潤是結直腸癌肝轉移公認的危險因素[2]，但其分子機制卻仍未明確。腫瘤轉移的其中一種機制是“種子-土壤”假說，即腫瘤擴散必須同時具備擴散的腫瘤細胞(種子)與適宜的轉移生長部位(土壤)，腫瘤細胞侵襲、突破周圍組織及基底膜，侵入血管并擴散至循環系統，最后在合適的靶器官定植、生長[3]。然而腫瘤細胞并非在各個器官中均會形成轉移灶，每種腫瘤都有自己偏好的轉移器官，即所謂的器官特異性轉移。最近研究表明，趨化因子受體及其配體除了參與淋巴細胞歸巢、細胞遷移黏附及炎癥發生等一系列病理生理反應外，還可能在腫瘤細胞增殖、血管新生及器官特異性轉移中起著非常重要的作用[4]。CXCL12/CXCR4是目前研究比較深入的一對趨化因子軸，靶器官大量分泌CXCL12，吸引循環中CXCR4陽性的腫瘤細胞在目標器官定植、生長，從而參與各種腫瘤的器官特異性轉移[5-7]。然而針對CXCL12/CXCR4的治療并不能完全抑制腫瘤轉移的發生[8]，因此其它趨化因子軸可能也共同參與其中。

CXCR6受體是趨化因子受體家族的另一個重要成員，它與唯一配體CXCL16的相互作用在前列腺癌的骨轉移中起著非常重要的作用，阻斷CXCR6/Akt/mTOR通路可以明顯抑制前列腺癌的血管新生及侵襲[9]。目前CXCL16/CXCR6在結直腸癌肝轉移中的作用仍不清楚。因此我們采用免疫組化方法檢測結直腸癌標本中CXCR6的表達情況，以期闡明CXCR6在結直腸癌同時性肝轉移中的作用及其臨床意義。

材 料 和 方 法

1臨床資料

收集中山大學附屬第一醫院2004年8月至2008年12月間外科手術切除的結直腸癌標本143例，取其中29例癌旁正常組織(距離腫瘤>5 cm)作為對照。其中男性93例，女性50例，年齡在25～87歲之間，平均60.3歲。結腸癌76例，直腸癌67例。伴有同時性肝轉移83例，無同時性肝轉移60例。腫瘤分化程度分為分化型癌(高、中分化型腺癌)及分化不佳型癌(低分化腺癌、未分化腺癌、印戒細胞癌和黏液腺癌)，其中分化型癌121例，分化不佳型癌22例。所有患者均有完整的臨床病案資料及隨訪資料，結直腸癌原發灶及轉移性淋巴結均經病理切片檢查證實，遠處轉移經病理學或影像學檢查證實。隨訪采用電話與信件方式結合的方式進行，隨訪終點為死亡或最終隨訪日(2011年12月)，隨訪時間為3～80個月，平均32個月。

2免疫組化檢測

取甲醛固定和石蠟包埋的腫瘤組織及癌旁正常組織切片至4 μm厚，經二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水后加入3%過氧化氫甲醇液中，室溫封閉10 min以抑制內源性過氧化物酶活性。切片在 0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中95℃下煮沸15 min修復抗原。PBS 漂洗1次后，滴加5%正常山羊血清，室溫封閉30min以阻斷非特異性反應，除去多余液體。加入兔抗人CXCR6多克隆抗體(1∶200稀釋，Abcam)4 ℃過夜；以PBS液代替Ⅰ抗作為陰性對照。PBS漂洗3次后，滴加多聚體抗兔IgG‐HRP，室溫孵育30 min。滴加試劑SABC。PBS漂洗3次后，DAB顯色，蒸餾水洗，蘇木素復染。乙醇和二甲苯脫水，中性樹脂常規封片。

3免疫組化結果判斷

采用Image-Pro Plus(IPP)6.0 軟件分析免疫組化圖片，先測量有效測量區域的面積，再測量該面積范圍內目標染色區域的累積吸光度值(integrated absorbance，IA)，兩者相除得到平均累積吸光度(mIA)，mIA與CXCR6表達呈正相關。

4統計學處理

應用SPSS 17.0軟件包(SPSS Inc)進行統計分析。同時性肝轉移與無肝轉移組間mIA比較采用Student’st-test。采用Kaplan-Meier法計算總體生存率并描繪生存曲線。采用Cox比例風險模型進行預后的單因素及多因素回歸分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1結直腸癌原發灶及癌旁組織CXCR6的表達

CXCR6在細胞質和細胞膜中呈不同程度的陽性表達，見圖1A、B，部分腫瘤間質浸潤的炎癥反應細胞亦呈CXCR6弱陽性表達，見圖1A。CXCR6在結直腸癌組織中呈不同程度陽性表達，見圖2A、B、C，而在癌旁正常組織中呈少量弱表達或不表達，見圖2D。

2CXCR6表達與結直腸癌同時性肝轉移的關系

143例結直腸癌患者的基本資料見表1。結直腸癌原發灶中CXCR6mIA在0.41～2.84之間，平均為1.54±0.04，其中同時性肝轉移病例的mIA為1.63±0.05，無肝轉移病例為1.41±0.08，兩組比較差異有統計學意義(t=2.529，P<0.05)。mIA在無淋巴結轉移與有淋巴結轉移病例中無明顯差異(P>0.05)，在無脈管浸潤與有脈管浸潤病例中亦無明顯差異(P>0.05)。

Figure 1. Expression of CXCR6(×400).: cell membrane; ?: intercellular matrix.

圖1CXCR6在細胞膜、細胞質及腫瘤間質中表達

Figure 2. Positive staining of CXCR6 (A:strong;B:intermediate;C:weak) in colorectal cancer and negative staining (D) in adjacent normal colorectal tissues(×400).

圖2CXCR6在結直腸癌和癌旁正常組織中的表達

表1143例結直腸癌患者基本資料

Table 1. Baseline characteristics of the patients with colorectal cancer (n=143)

CharacteristicsDataAge[year.x±s(range)]60.3±1.1(25～87)Age≥60[n(%)]83(58.0)Male[n(%)]93(65.0)CXCR6mIA[x±s(range)]1.54±0.04(0.41～2.84)CXCR6mIA≥1.54[n(%)]66(46.7)Rectalcancer[n(%)]67(46.9)Tumorsize≥5cm[n(%)]95(66.4)Undifferentiatedtumor[n(%)]22(15.4)Lymphovascularinvasion[n(%)]38(26.6)T3～T4[n(%)]131(91.6)Lymphnodemetastasis[n(%)]105(73.4)Synchronouslivermetastasis[n(%)]83(58.0)

mIA：mean integrated absorbance

3CXCR6表達與結直腸癌患者預后的關系

根據CXCR6mIA的平均值1.54將病例劃分為CXCR6高表達組(mIA≥1.54)和CXCR6低表達組(mIA<1.54)，結果CXCR6低表達組1、3、5年總體生存率分別為81.8%、53.2%和32.3%，CXCR6高表達組1、3、5年總體生存率分別為81.8%、28.4%和11.2%，兩組總生存率比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Overall survival rate in high CXCR6 expression group was poorer than that in low CXCR6 expression group (P<0.05).

圖3CXCR6表達與結直腸癌患者預后呈負相關

Cox單因素分析發現CXCR6、淋巴結轉移、同時性肝轉移及脈管浸潤及年齡與結直腸癌患者總生存率相關，但多因素分析結果提示，只有年齡(P<0.05)、淋巴結轉移(P<0.05)和同時性肝轉移(P<0.01)為結直腸癌患者預后的獨立危險因素，CXCR6為非獨立危險因素，見表2。

83例同時性肝轉移結直腸癌患者的中位生存時間為21個月，其中CXCR6高表達者為21個月，CXCR6低表達者為18個月，兩者差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4A。60例無同時性肝轉移的I～III期結直腸癌患者中位生存時間為45個月，其中CXCR6高表達者為31個月，CXCR6低表達者為56個月，兩者差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4B。

討 論

CXCR6受體是跨膜G蛋白偶聯受體超家族成員之一，其N 端區域與趨化因子配體結合, 胞內區與G蛋白偶聯,而C 端具有多個可磷酸化絲氨酸/蘇氨酸殘基, 主要參與細胞信號轉導。趨化因子配體與受體結合后在淋巴組織生成、淋巴細胞歸巢、細菌感染、類風濕性關節炎及皮膚病等一系列病理生理活動中起著非常重要的作用[10-12]，近年還發現其與腫瘤的發生、發展和轉移有關。

表2 143例結直腸癌患者預后單因素及多因素Cox回歸分析

OR: odd ratio； CI： confidence interval.

Figure 4. High CXCR6 expression was associtated with poorer overall survival in the patients with stage I～III colorectal cancer (P<0.01, B) but not those with synchronuse liver metastasis (P>0.05, A)

圖4CXCR6表達與結直腸癌同時性肝轉移患者預后的關系

本研究結果表明，CXCR6主要在癌組織中表達，而在癌旁正常組織弱表達或不表達，這表明CXCR6參與了結直腸癌的發生。鑒于CXCR6在癌組織中廣泛表達，我們難以利用傳統的肉眼評判標準作出準確的判斷，因此本研究采用了IPP 6.0圖像分析系統測平均密度的方法進行結果判斷。我們發現CXCR6表達與同時性肝轉移的發生有關(P<0.05)，但與淋巴結轉移及脈管浸潤無關，該結果與既往的研究是一致的[13-14]。Cambien等[13]的研究發現，阻斷CXCR3可顯著減少HT29細胞肺轉移的發生，卻不能抑制肝轉移。因此腫瘤轉移是非隨機的器官選擇性過程，不同類型的癌轉移目的地不同，不同的趨化因子信號通路在不同的器官特異性轉移中所起的作用。此外，現已明確CXCL16在肝細胞、膽管上皮細胞及竇狀隙內皮細胞陽性表達[15-16]，這進一步為CXCL16/CXCR6參與肝轉移的發生提供了強有力的證據。

對于趨化因子是否系腫瘤患者預后的獨立危險因素，目前各家報道差異較大[17-19]。我們研究發現，盡管CXCR6高表達組的總體生存率明顯比低表達組低，但經過淋巴結轉移、同時性肝轉移、脈管浸潤及年齡等多因素校正后，我們發現CXCR6并不能作為結直腸癌患者預后的獨立危險因素。盡管CXCR6表達情況與IV期肝轉移患者預后無關，但其與I-III期結直腸癌患者的預后呈負相關，這與近年日本的一項研究的結果是一致的[20]。他們發現I～III期結直腸癌患者血清中的CXCL16水平與異時性肝轉移的發生呈正相關，術前血清CXCL16水平可用于預測結直腸癌患者肝轉移的發生[20]。

綜上所述，CXCR6與結直腸癌同時性肝轉移相關，結直腸癌組織中CXCR6的表達水平檢測對評估結直腸癌的轉移及預后有一定的指導意義。CXCL16/CXCR6參與肝轉移的具體分子機制及其與異時性肝轉移的關系仍需進一步研究。CXCR6可望成為結直腸癌肝轉移治療的一個重要靶點。

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ExpressionandclinicalsignificanceofchemokinereceptorCXCR6inprimarycolorectalcancer

CHEN Zhi-hui, SONG Xin-ming, LI Xin-xin, HE Yu-long

(DepartmentofGastrointestinalandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:bigo_sysu@163.com)

AIM: To investigate the expression of chemokine receptor CXCR6 in primary colorectal cancer and determine the association between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis.METHODSThe colorectal cancer tissues from 143 patients were collected from August 2004 to December 2008 in the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University. Twenty-night cases of the adjacent normal colorectal tissues were enrolled as controls. The expression of CXCR6 was detected by immunohistochemistry and the mean intergrated absorbance (mIA) was calculated by Image-Pro Plus 6.0 software. The relationship between CXCR6 expression and synchronous liver metastasis/prognosis was analyzed.RESULTSThe CXCR6 staining was mainly positive in colorectal cancer tissues but not in adjacent normal colorectal tissues. ThemIAof CXCR6 in colorectal cancer was 1.54±0.04 (range: 0.41～2.84), and was 1.63±0.05 and 1.41±0.08 (P<0.05) in the cases with (n=83) or without (n=60) synchronous liver metastasis, respectively. According to the meanmIAof CXCR6 (1.54), the cases was divided into high CXCR6 group (mIA≥1.54) and low CXCR6 group (mIA<1.54). The overall survival rate in high CXCR6 group was significantly lower than that in low CXCR6 group (P<0.05). In multivariate Cox regression models, age (P<0.05), lymph node metastasis (P<0.05) and synchronous liver metastasis (P<0.01) but not CXCR6 were identified as independent risk factors for poor outcome. In subgroup analysis, high CXCR6 expression was associated with poorer survival in the patients with stage I～III colorectal cancer (P<0.01) but not those with synchronous liver metastasis (P>0.05).CONCLUSIONCXCR6 in primary colorectal cancer tissues is associated with liver metastasis. It may become a potential target for the treatment of colorectal cancer liver metastasis.

Colorectal neoplasms; Chemokines; CXCR6 protein,human; Liver metastasis; Prognosis

R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.008