磷酸化缺陷型RARα1受體對人多發性骨髓瘤細胞體外增殖的影響*

郭小娟, 鄭 冬△, 王安訓, 李 娟, 夏 盈

(中山大學附屬第一醫院 1血液內科; 2口腔外科，廣東 廣州 510080)

1000-4718(2012)05-0816-07

2012-02-23

2012-04-01

廣東省科技計劃項目(No.2011B031800139)

△通訊作者 Tel: 020-87755766-8831; E-mail: zcxzd@tom.com

磷酸化缺陷型RARα1受體對人多發性骨髓瘤細胞體外增殖的影響*

郭小娟1, 鄭 冬1△, 王安訓2, 李 娟1, 夏 盈1

(中山大學附屬第一醫院1血液內科;2口腔外科，廣東 廣州 510080)

目的研究磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)對人多發性骨髓瘤(MM)細胞增殖的影響。方法(1)RT-PCR檢測U266 細胞RARα受體亞型mRNA的表達；(2)RARαS77A過表達慢病毒載體的構建，慢病毒包裝，滴度測定及MM細胞轉染；(3)CCK-8檢測全反式維甲酸(ATRA,0～100 μmol/L)處理或RARαS77A過表達慢病毒轉染后U266 細胞的增殖；(4)Western blotting檢測RARαS77A過表達慢病毒轉染或ATRA處理后U266 細胞增殖相關蛋白Rb和P53的表達。結果(1)U266為RARα1(+)、RARα2(-)細胞；(2)ATRA明顯抑制U266 細胞增殖，其作用呈時間和劑量依賴性；RARαS77A過表達慢病毒轉染48 h 后U266細胞增殖明顯被抑制，抑制率為15.16%±3.84%；(3)RARαS77A過表達慢病毒轉染及ATRA處理均可上調U266細胞Rb蛋白表達及下調其P53蛋白表達。結論磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA均可通過上調Rb及下調P53表達抑制RARα1(+)、RARα2(-)的U266細胞增殖，提示降低維甲酸受體RARα1的磷酸化是ATRA抑制MM細胞增殖的一個重要作用途徑。

多發性骨髓瘤； 受體，維甲酸； 磷酸化； 細胞增殖

多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統常見腫瘤，傳統化療效果較差，目前仍被認為是一種不能治愈的疾病。雖然自體造血干細胞移植術和萬珂等新藥的臨床應用大大提高了MM患者的無病生存時間，但由于耐藥的出現以及復發的不可避免，新的藥物研發以及新的治療方式的探索仍然是目前急需解決的問題。自從1985年全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)聯合化療作為急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)的誘導和鞏固治療方案應用于臨床,初治APL患者的完全緩解率(complete remission,CR)提高至90%～95%，5年無病生存率(disease-free survival,DFS)提升至 74%。ATRA的出現將APL從致死率最高的急性髓細胞白血病(AML)類型轉變為臨床預后最好的類型。自此，近年來大量的研究將ATRA應用于許多實體腫瘤上，研究報道ATRA可以誘導許多腫瘤細胞產生再分化和凋亡的作用，抑制腫瘤細胞的生長，如口腔鱗癌、乳腺癌、肺癌、胃癌以及胰腺癌等。同樣，對于大多數MM細胞株，ATRA均具有抑制其生長增殖的作用[1]；對于骨髓中新鮮分離的MM細胞增殖，其抑制作用呈劑量依賴性[2]。隨后大量研究發現ATRA不僅可以抑制MM細胞的增殖，同時可以促使MM細胞凋亡，其可通過調節 MM細胞的Fas抗原發揮對MM細胞增殖及誘導MM細胞凋亡，而聯合抗Fas抗體可增強其抑制增殖及促凋亡作用。ATRA聯合地塞米松可降低MM細胞白細胞介素-6受體(interleukin-6 receptor,IL-6R)及B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)的表達，增加地塞米松的細胞毒作用以及其促進細胞凋亡的作用，通過上調p21WAF1以及減低磷酸化Rb蛋白的表達來抑制MM細胞增殖[3]。然而維甲酸的分化綜合征及高鈣血癥等不良反應限制了傳統的維甲酸類藥物的進一步發展及對MM患者的臨床應用，改進和研發靶向性高、毒副作用小的維甲酸類藥物成為了目前的一個研究方向。既往研究發現ATRA主要是通過維甲酸受體α(retinoic acid receptor alpha,RARα)的轉錄調控發揮效應的[4]，其中RARα的 轉錄激活作用主要通過RARα1受體AF-1區域第77位絲氨酸的磷酸化實現[5]。RARα1與cyclin H/CDK7復合物結合以及將RARα1受體氨基酸末端第77位絲氨酸磷酸化可增強RARα的反式激活作用，而ATRA通過抑制cyclin H/CDK7的表達而降低RARα1氨基酸末端第77位絲氨酸的磷酸化來發揮作用[6]。磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1可以模擬ATRA的作用誘導腫瘤細胞出現G1期阻滯從而抑制細胞增殖及誘導再分化作用[7-9]。本研究通過構建磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1 (RARαS77A)過表達的慢病毒轉染MM細胞U266，研究其對MM細胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1細胞株及主要試劑

人胚腎細胞株293T和人MM細胞株U266均來源于ATCC，胎牛血清購于HyClone。ATRA購于Sigma;EcoRⅠ及NheⅠ限制性內切酶購于NEB;Lipofectamin2000購于Invitrogen;逆轉錄試劑盒、PCR試劑及Trizol購于TaKaRa;PCR引物由上海生工合成，質粒中提試劑盒及DH-5α感受態大腸桿菌購于天根，Cell Counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒購買于DOJINDO Laboratory;全蛋白提取及BCA蛋白定量試劑盒購自凱基生物，兔抗人P53單克隆抗體及鼠抗人Rb單克隆抗體購于Cell Signaling Technology,兔抗人GAPDH單克隆抗體及IgG/HRP Ⅱ抗購于博奧森，PVDF膜(0.45 μm)為Millipore產品。

2細胞培養

293T和U266細胞分別于含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM和RPMI-1640完全培養基中(Gibco)，37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中恒溫培養， U266細胞濃度維持在(5～10)×1018/L，所有細胞長到對數期即可用于實驗研究。

3RT-PCR檢測U266細胞RARα受體亞型(RARα1及RARα2)的表達情況

離心收集未干預的對數生長期U266細胞，提取細胞總RNA并將其逆轉錄為cDNA, 引物序列如表1所示，其中β-actin (196 bp)為用于標準化各個樣本cDNA含量的管家基因。PCR循環過程如下：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 1 min,61 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環，72 ℃ 5 min。收集PCR產物于1.5% 瓊脂糖凝膠行電泳分析(100 V 30 min), 將凝膠取出后于紫外凝膠成像系統成像分析。

表1 RT-PCR引物序列

4磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過表達質粒的構建及慢病毒包裝

本研究的磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過表達載體為上海吉瑪公司構建，具體構建過程如下：提取RARα1(+)MM細胞株U266總RNA并逆轉錄成cDNA, RT-PCR反應后經過DNA膠回收獲取RARα1模板cDNA，測序驗證后通過PCR擴增反應在已獲取的RARα1目的基因序列兩端加入酶切位點EcoRⅠ及NheⅠ，將上述PCR產物雙酶切獲得含酶切位點RARα1模板cDNA，通過T4DNA連接酶將上述膠回收產物連接線性化空質粒構建質粒pGLV1-CMV-RARα1，測序驗證；通過點突變的方法(Stratagene)將所購建質粒RARα1第77位編碼絲氨酸的密碼子TCG突變成GCG，挑選陽性克隆進行核甘酸測序分析，得到突變型RARα1受體pGLV1-CMV-RARαS77A質粒，RARαS77A編碼蛋白的磷酸化缺陷驗證在Rochette-Egly等的研究中通過[32P]放射性同位素標記等方法證實[5, 7, 10]。構建含無關序列的帶增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的慢病毒穿梭質粒為對照。將構建含RARαS77A目的基因的慢病毒穿梭質粒行雙酶切反應驗證構建質粒的正確性后將穿梭質粒pGLV1-CMV-RARαS77A 或者pGLV1-CMV-NC-EGFP 40 μg, 包裝質粒混合物(pG-p1-VSVG,PG-P3-RRE,PG-P2-RRE)42 μg及適量Lipofectamine 2000轉染試劑混勻加入DMEM完全培養基中共同轉染293T細胞，72 h收集培養液上清離心超濾即可得到病毒純化液。

5病毒滴度測定及靶細胞轉染

將293T 細胞接種于96孔板，5×103cells/well，第2 d將病毒液10倍稀釋呈3～5個梯度，并加入終濃度5 mg/L 聚凝胺(polybrene)，移去舊培養液加入稀釋好的病毒液100 μL, 5% CO2、37 ℃培養過夜，第3 d換液，第4 d根據細胞狀態將細胞分出1/3～1/5繼續培養，第5 d熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，結合稀釋倍數估計病毒滴度。將U266細胞分5×103cells/well 及1×104cells/well 2個濃度接種于96孔板, 分別用MOI=1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100 5個梯度的表達EGFP的對照病毒侵染，加入polybrene(5 mg/L)增強病毒感染力，培養24、48、72、96 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并選擇熒光表達高的轉染組行流式細胞術檢測EGFP陽性表達率。本研究中選取MOI=1∶50，并加用polybrene(5 mg/L)對U266細胞進行侵染(96孔板 1×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)，慢病毒轉染后24 h培養液加倍，轉染后48 h 收集細胞行增殖及Western blotting實驗。

6ATRA處理U266細胞

將ATRA粉末溶解于無水乙醇配制濃度為104μmol/L的儲存液, RPMI-1640培養基將其稀釋至0～100 μmol/L后加入U266細胞實驗組(96孔板中 2×104cells/well，12孔板 2×105cells/well)進行藥物干預，≤ 1‰無水乙醇設為對照組，加藥完畢將培養板放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內避光培養。

7CCK8檢測U266細胞增殖

取對數期U266細胞接種于96孔板，2×104cells/well ，加藥處理后于37 ℃、5% CO2培養箱中分別避光培養24、48、72、96 h，以不含細胞但含1 μmol/L ATRA的RPMI-1640培養基為空白組；慢病毒轉染組分實驗組(RARαS77A過表達的慢病毒轉染組)和對照組(對照慢病毒轉染組)，細胞數為1×104cells/well，轉染后分別培養48 h及72 h，以不含細胞的RPMI-1640培養基為空白組。ATRA處理組及慢病毒轉染組每組均設3個復孔，在處理好的細胞中加入CCK-8試劑(10 μL/well)，培養箱中避光孵育1～4 h，酶標儀450 nm 波長下測試每個樣孔的吸光度值(A)，根據公式計算細胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。

IR(%)=100%-(對照組A-空白組A)/(實驗組A-空白組A)×100%。

8Westernblotting檢測U266細胞增殖相關蛋白的表達

提取12孔板經過ATRA(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)處理及慢病毒轉染48 h后的U266細胞蛋白，測蛋白濃度、定量、變性。配制12%的蛋白分離膠及3.75%濃縮膠，蛋白上樣及電泳后轉移至PVDF膜中，0.5% 脫脂奶粉封閉 1 h, 分次加入0.5%BSA 稀釋的抗體P53(1∶500)，Rb (1∶500)4 ℃孵育12～16 h,洗膜，加入0.5% BSA稀釋的Ⅱ抗(1∶3 000),室溫孵育1 h,洗膜，取出放入曝光暗盒，至暗房加ECL發光液于膜上反應，壓膠片，曝光，顯影，定影，再將膜取出用Striping buffer 洗脫后，重復上述封閉步驟，加入內參照抗體GAPDH(1∶1 000)同上顯影，定影。用 Quantity One(Bio-Rad) 進行灰度分析。

9統計學處理

結 果

1U266細胞中RARα受體亞型(RARα1及RARα2)的表達

所用引物RARα1、RARα2及β-actin PCR產物分別為200 bp、300 bp和196 bp，RT-PCR檢測U266細胞為RARα1(+)、RARα2(-)的人MM細胞，見圖1。

Figure 1. The expression of RARα1 and RARα2 mRNA in human multiple myeloma U266 cells detected by RT-PCR.

圖1RT-PCR檢測U266細胞株中RARα1和RARα2mRNA的表達

2磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1過表達質粒的驗證

pGLV1-CMV-RARαS77A質粒擴增抽提后用限制性內切酶EcoRⅠ以及NheⅠ進行雙酶切反應，酶切產物電泳后凝膠成像圖譜見圖2(RARαS77A為1 376 bp)，酶切質粒中可見與目的基因片段大小一致的清晰條帶，未酶切質粒中只有一單一片段。

Figure 2. The detection of RARαS77A fragment by double-enzyme cleavage analysis in the recombinant plasmid (pGLV1-CMV-RARαS77A). M: marker;Lane 1:lentivirus expression plasmid digested by endonuclease;Lane 2:the complete lentivirus expression plasmid.

圖2雙酶切反應驗證在重組質粒PGLV1-CMV-RARαS77A中的RARαS77A片段

3ATRA對U266細胞增殖的影響

不同濃度的ATRA(0～100 μmol/L)處理48 h后, U266細胞增殖受到明顯抑制(P<0.05)，見圖3A，半數抑制濃度(IC50)為 62.65 μmol/L，藥物濃度增加，細胞增殖抑制率相應升高。用4個濃度ATRA(0 μmol/L、 1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)分別處理24、48、72和96 h 后，ATRA對U266細胞增殖抑制率伴隨處理時間延長而升高，見圖3B。

圖3ATRA對U266細胞增殖的影響

4慢病毒轉染驗證以及RARαS77A過表達慢病毒轉染對U266細胞增殖的影響

病毒轉染U266細胞48 h后可見大量熒光表達，流式細胞術檢測U266細胞中EGFP陽性表達率為52.66%，見圖4A。經過RARαS77A過表達慢病毒轉染48 h后，U266細胞的增殖受到明顯抑制(P<0.01)，其抑制率為15.16%±3.84%，見圖4B。

5磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)及ATRA對U266細胞增殖相關蛋白表達的影響

ATRA處理48 h后，U266細胞中Rb蛋白表達較對照組升高(圖5A、6A)(P<0.05)， P53蛋白的表達較對照組下降(圖5C、6C)(P<0.05)。與對照慢病毒轉染組比較，在RARαS77A過表達慢病毒轉染48 h后的U266細胞中同樣檢測到Rb蛋白表達升高(圖5B、6B)(P<0.05)，P53蛋白表達水平下降(圖5D、6D)(P<0.05)。以上結果證明磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA一樣均通過上調Rb蛋白表達、下調P53的表達實現對U266細胞增殖的抑制作用。

討 論

維甲酸(retinoic acid,RA)是視黃醇(即維生素A)的活性分子衍生物，是一種普遍存在于幾乎所有細胞中的信號分子，其對胚胎的發育、器官的生成、組織的恒定以及細胞的增殖分化及凋亡有深遠的影響[11]，在癌癥治療上維甲酸可以促進腫瘤細胞的分化和/或誘導對藥物聯合作用的敏感蛋白表達，是目前臨床上應用最為成功的分化誘導劑。

圖4RARαS77A慢病毒轉染效率的評估及其對U266細胞增殖的影響

維甲酸主要通過作用于RARα發生作用，RARα1及RARα2為大量存在于人體的兩種主要的

RARα的亞型，其中RARα1在各種組織中的表達水平相似，而RARα2為組織特異性表達，其表達水平隨著RA及G-CSF的誘導分化作用而上調。曾有研究者對所收治的80例初治的MM病人進行RARα亞型的檢測，發現RARα1普遍存在于所有病人中，而RARα2(+)僅占32.5%，RARα2的表達與多發性骨髓瘤的疾病進展以及ATRA的治療效果緊密相關，表達RARα2的患者總生存時間較不表達者短；高表達的RARα2刺激了STAT及MEK/Erk途徑，敲除其的表達將抑制MM細胞的增殖及促進其凋亡，因此增加RARα2的表達可以增加RARα2表達陰性的MM細胞株對ATRA藥物作用的敏感性[12]。而對于本研究中細胞株U266均為RARα2(-)表達的細胞株，磷酸化缺陷型RARα1受體與ATRA一樣均可以抑制其細胞增殖，提示在缺少RARα2表達的細胞中ATRA主要通過降低RARα1的磷酸化來發揮抑制MM細胞增殖的作用。

RARα作為一種磷酸化蛋白，正常情況下增強其磷酸化水平可促進細胞的增殖，在細胞核受體途徑進行信號轉導發揮轉錄激活作用。RARα1受體通過與cyclin H及 CDK 結合導致RARα1受體AF-1反式激活區域的第77位絲氨酸磷酸化可增強RARα1受體的轉錄激活作用[5, 13]，增強細胞增殖能力，磷酸化缺陷型的RARα1受體可以模擬維甲酸的作用，對EGFR產生作用，介導AP-1的表達，誘導細胞G1期阻滯從而減少細胞進入S期的量達到抑制腫瘤細胞的增殖[8]。研究顯示ATRA通過抑制CAK復合物(cyclinH, CDK,MAT1)活性抑制RARα1受體磷酸化后可以抑制腫瘤細胞增殖及促進癌細胞再分化，將磷酸化缺陷型RARα1受體(RARαS77A)整合到腫瘤細胞內同樣可以發揮抑制腫瘤細胞增殖及促進癌細胞再分化的作用，其作用在急性早幼粒白血病、骨肉瘤及神經母細胞瘤中已得到證實[9, 10, 14]。

Figure 5. The expression of Rb and P53 in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A detected by Western blotting. A：Rb expression in U266 cells treated with ATRA；B: Rb expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A; C:P53 expression in U266 cells treated with ATRA ; D: P53 expression in U266 cells transfected with lentivirus RARαS77A .

圖5RARαS77A過表達慢病毒轉染或ATRA處理后U266細胞Rb和P53蛋白的表達

圖6RARαS77A過表達慢病毒轉染或ATRA處理后U266細胞Rb和P53蛋白的表達

本研究將磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1(RARαS77A)過表達慢病毒轉染人MM細胞U266中，發現其可以模擬ATRA的作用抑制U266細胞增殖，且磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1與ATRA一樣在作用U266細胞后均可出現Rb蛋白表達的升高及P53蛋白表達的下降。既往研究已經證實Rb是一種抑癌基因，其表達升高可以抑制腫瘤的生長和形成，而正常的p53基因也是一種腫瘤抑制基因，但在惡性腫瘤細胞中50%以上的p53基因會出現該基因的突變，成為了一種腫瘤的促進因子，而本研究U266細胞中的p53基因是屬于突變型的[15]。因此本實驗發現磷酸化缺陷型維甲酸受體RARα1可以模擬ATRA抑制MM細胞增殖，其作用均是通過上調Rb蛋白表達及下調P53蛋白表達來實現的。本實驗結果進一步證實在ATRA抑制MM細胞增殖的作用中，降低維甲酸受體RARα1的磷酸化是重要的作用途徑，對維甲酸相關藥物的研發有重要意義。

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Effectsofphosphorylation-defectiveretinoicacidreceptorα1onproli-ferationofhumanmultiplemyelomacellsinvitro

GUO Xiao-juan1, ZHENG Dong1, WANG An-xun2, LI Juan1, XIA Ying1

(1DepartmentofHematology;2DepartmentofOralSurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SUNYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zcxzd@tom.com)

AIM: To investigate the effect of phosphorylation-defective retinoic acid receptor α1 (RARα1) on the proliferation of human multiple myeloma cells.METHODSThe mRNA expression of RARα subtypes in U266 cells was detected by RT-PCR. Lentiviral plasmid construction, viral production, titer determination and cell transfection were carried out by the general methods of molecular biology. Proliferation analysis was performed with CCK-8 assay. The U266 cells were treated with all-transretinoic acid (ATRA,0～100 μmol/L) or transfected with lentivirus RARαS77A. The expression levels of proliferation-related proteins, P53 and Rb, in U266 cells treated with ATRA or transfected with lentivirus RARαS77A were detected by Western blotting.RESULTSRARα1 was positively expressed in U266 cells and RARα2 expression was negative. ATRA significantly inhibited the proliferation of U266 cells in a dose- and time-dependent manner. Proliferation of U266 cells was significantly inhibited 48 h after transfection with lentivirus RARαS77A, and the inhibitory rate was 15.16%±3.84%. The up-regulated expression of Rb and down-regulated expression of P53 were detected in U266 cells not only in the cells treated with ATRA, but also in the cells transfected with lentivirus RARαS77A.CONCLUSIONPhosphorylation-defective RARα1 (RARαS77A) mimics the growth inhibitory effect of ATRA on U266 cells that express RARα1 (+) and RARα2 (-) via down-regulating the expression of P53 and up-regulating the expression of Rb, suggesting that the antiproliferative effect of ATRA is mainly mediated by decreasing the phosphorylation of RARα1.

Multiple myeloma; Receptors, retinoic acid; Phosphorylation; Cell proliferation

R453.9

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.009