鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制

曾 葭， 劉成成， 祝愛珍， 陳小宇， 譚廣銷， 劉革修△

(1中國人民解放軍411醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200081；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)05-0834-05

2012-03-02

2012-03-12

△通訊作者 Tel:020-85220262; E-mail:tliugx@jnu.edu.cn

鹽霉素抑制人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制

曾 葭1， 劉成成2， 祝愛珍2， 陳小宇2， 譚廣銷2， 劉革修2△

(1中國人民解放軍411醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200081；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

目的探討鹽霉素對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能機(jī)制。方法采用MTT法檢測鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位(ΔΨm)的影響；比色法檢測caspase-3、8和9活性；Western blotting分析細(xì)胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(p-LRP6)蛋白水平。結(jié)果鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長具有劑量依賴性抑制作用。0.2 μmol/L鹽霉素作用于A549/DDP細(xì)胞，ΔΨm顯著下降，而細(xì)胞內(nèi)活性氧和Ca2+濃度在短期顯著升高，胞漿細(xì)胞色素C蛋白水平、caspase-3、8和9酶活性均顯著增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Bcl- 2 的表達(dá)下調(diào)，Bax 的表達(dá)明顯增加，Bcl-2/Bax 比值顯著降低。48 h時(shí)增殖抑制率為(34.61±1.97)%，細(xì)胞凋亡率為(18.74±2.08)%。鹽霉素也減少A549/DDP細(xì)胞內(nèi)β-catenin和p-LRP6蛋白水平。結(jié)論鹽霉素通過抑制Wnt信號(hào)通路抑制A549/DDP細(xì)胞增殖，通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP凋亡。

鹽霉素; 肺腫瘤; 順鉑; 細(xì)胞凋亡; β-catenin; 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6

肺癌是目前發(fā)生率與死亡率最高的惡性腫瘤,其中以非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)為主,而且NSCLC患者確診時(shí)多數(shù)已到晚期，手術(shù)難以徹底清除,以鉑類為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療方案和表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)是當(dāng)前針對(duì)EGFR基因突變的晚期NSCLC患者首選治療措施,但對(duì)EGFR基因不存在突變者只有少數(shù)治療有效，而且多數(shù)容易出現(xiàn)耐藥復(fù)發(fā)現(xiàn)象。越來越多的研究表明,腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)的根本原因是腫瘤干細(xì)胞的存在。因此，尋找新的清除腫瘤干細(xì)胞的藥物以減少耐藥與復(fù)發(fā)十分必要。最近Gupta等[1]研究發(fā)現(xiàn)一種名為鹽霉素(salinomycin)的抗生素可以直接殺死腫瘤干細(xì)胞，其殺死小鼠乳腺癌干細(xì)胞的效力比普通抗癌藥物泰克索(Taxol)高100倍。本實(shí)驗(yàn)觀察鹽霉素對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP增殖的抑制作用及其可能機(jī)制，為鹽霉素應(yīng)用于肺腺癌治療探索新的思路。

材 料 和 方 法

1主要試劑

鹽霉素(S4526)、臺(tái)盼藍(lán)(T0776)、Triton X-100(T8787)、DMSO(D2650)和PI染料(P4170)購自Sigma, RPMI-1640 培養(yǎng)液(R0883)和胎牛血清(10082-139)購自Gibco，細(xì)胞內(nèi)活性氧(S0033)、caspase-3酶活性(C1115)、caspase-8酶活性(C1152)、caspase-9酶活性(C1158)以及JC-1線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,ΔΨm)檢測試劑盒(C2006)購自碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞色素C凋亡檢測試劑盒(Catalog BioVision)，F(xiàn)luo-3AM(Biotium)，Epics XL 型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)。

2細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。用含10% 胎牛血清、100 mg/L青霉素及100 mg鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液置于含5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。

3鹽霉素對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用

檢測鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的劑量-效應(yīng)關(guān)系時(shí)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為5×107/L，每孔180 μL，鹽霉素設(shè)有0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L濃度梯度，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)DMSO對(duì)照孔和不加細(xì)胞的調(diào)零孔，5%CO2、飽和濕度、37 ℃孵育48 h，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后低速離心10 min,吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定吸光度(A)值。細(xì)胞生長抑制率=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-空白組平均A值)/(對(duì)照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值。繪制0.2 μmol/L鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的時(shí)間-效應(yīng)曲線，孵育時(shí)間：0、24、48、72、96 h，測量方法同上。

4AnnexinV-PI雙染測定細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長的A549/DDP細(xì)胞，每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至12孔板內(nèi)，設(shè)鹽霉素(0.2 μmol/L)處理組、鹽霉素(非細(xì)胞毒性濃度0.1 μmol/L)與順鉑(2 mg/L)聯(lián)合處理組、單純順鉑(2 mg/L)組和對(duì)照組，對(duì)照組加入1% DMSO，作用48 h后，消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌，棄上清，加入200 μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞后，分別加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min，再加入300 μL結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測。

5ΔΨm、活性氧和胞質(zhì)Ca2+釋放的檢測

取對(duì)數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至12孔板，加入鹽霉素(0.2μmol/L)處理，在6 h、12 h、24 h時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍。500 μL JC-1(10 mg/L)重懸細(xì)胞檢測ΔΨm，500 μL DCFH-DA (5 μmol/L)重懸細(xì)胞檢測細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧，10 μmol/L熒光染料 Fluo-3AM檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm, 發(fā)射波長為530 nm。

6檢測caspase-3、caspase-8和caspase-9活性

取對(duì)數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種至12孔板，加入鹽霉素(0.2 μmoL/L)，分別處理0、12、24 h, 按照試劑盒說明收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌后重懸于細(xì)胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清加入顯色底物(caspase-3底物Ac-DEVD-pNA、caspase-8底物Ac-IETD-pNA和caspase-9底物Ac-LEHD-pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，避光孵育4 h，酶標(biāo)儀在波長405 nm處檢測A值。

7Westernblotting檢測蛋白水平

取對(duì)數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，分別以0.2 μmoL/L鹽霉素處理48 h，收集細(xì)胞PBS洗2遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白；細(xì)胞色素C凋亡測定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑測定蛋白濃度，取蛋白50 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液(20 mmol/L Tris,pH 7.6;0.1% Tween 20)封閉過夜。鼠抗人細(xì)胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin抗體(Santa Cruz)、磷酸化低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6,p-LRP6) (Ser1490)抗體 (Cell Signaling Technology)或GAPDH (Chemicon International) 4 ℃孵育過夜，1∶2 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠Ⅱ抗室溫孵育1 h，用TBST洗3次，ECL顯色液顯色。目的條帶用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH內(nèi)參照校正。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用

鹽霉素在0.1～1.6 μmoL/L之間對(duì)A549/DDP細(xì)胞的生長抑制作用呈劑量依賴性：0.1 μmoL/L即有明顯作用，0.2、0.4、0.8和1.6 μmoL/L鹽霉素增殖抑制率分別為(34.61±2.97)%、(59.64±3.23)%、(83.75±3.32)%和(95.74±3.47)%，P<0.05，見圖1A。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得IC50=0.33 μmoL/L。0.2 μmoL/L鹽霉素處理A549/DDP細(xì)胞24 h時(shí)即顯示明顯增殖抑制作用[(17.93±2.18)%]，隨著時(shí)間延長抑制作用越來越明顯，72 h細(xì)胞抑制率(51.43±3.24)%，96 h為(64.58±3.38)%，見圖1B。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示0.2 μmoL/L鹽霉素能夠誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)明顯亞G1二倍體峰，且隨著時(shí)間的增加，作用越明顯，48 h時(shí)細(xì)胞凋亡(18.74±2.08)%，見圖2。

圖1鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞的生長抑制作用

Figure 2. Salinomycin induced apoptosis of A549/DDP cells.

圖2鹽霉素誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞凋亡

2鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞ΔΨm、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

0.2 μmoL/L鹽霉素作用于A549/DDP細(xì)胞之后，ΔΨm在6 h時(shí)已顯著下降，24 h時(shí)下降至最低，為對(duì)照組的(21.7±2.3)%；細(xì)胞內(nèi)活性氧在6 h時(shí)已顯著升高，24 h時(shí)仍然高于對(duì)照組水平[(142.7±4.3)%]；細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在6 h時(shí)已顯著升高，為對(duì)照組的(154.9±5.6)%，24 h時(shí)下降至接近對(duì)照組水平，見圖3。

圖3鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞線粒體膜電位、活性氧和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響

3鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影響

0.2 μmol/L鹽霉素處理A549/DDP細(xì)胞后，隨著時(shí)間的增加，caspase-3、caspase-8和caspase-9

的活性逐漸增加，呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。這表明caspase-3、caspase-8和caspase-9參與了鹽霉素的凋亡途徑。

圖4鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性的影響

4鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影響

0.2 μmol/L鹽霉素作用A549/DDP細(xì)胞48 h，不僅Bcl- 2 表達(dá)下調(diào)，Bax 表達(dá)明顯增加，使Bcl-2/Bax 比值顯著降低，而且胞漿細(xì)胞色素C 顯著增加，Wnt信號(hào)通路β-catenin和p-LRP6蛋白水平也顯著下降，見圖5。這說明鹽霉素影響了Bcl-2/Bax和細(xì)胞色素C這2條凋亡途徑，同時(shí)抑制A549/DDP細(xì)胞Wnt信號(hào)通路。

圖5鹽霉素對(duì)A549/DDP細(xì)胞中細(xì)胞色素C、Bcl-2、Bax、β-catenin和p-LRP6蛋白水平的影響

討 論

鹽霉素屬于聚醚類一元羧酸，由白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)發(fā)酵產(chǎn)生，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是典型的離子載體抗生素，它對(duì)細(xì)胞中的陽離子，尤其K+、Na+、Rb+的親和力特別強(qiáng)，使生物所必需的陽離子通過膜上脂質(zhì)屏障的浸透性增強(qiáng)，妨礙細(xì)胞內(nèi)外陽離子的傳遞，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而影響滲透壓，最終使細(xì)胞崩解，起到殺菌作用。

細(xì)胞凋亡程序是一個(gè)復(fù)雜的、涉及多基因的過程，主要有線粒體和細(xì)胞表面受體介導(dǎo)這兩條途徑。Bcl-2家族、線粒體細(xì)胞色素C及caspase是細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路的基本成分[2-5]。Caspase被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白，一旦活化發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，凋亡即進(jìn)入不可逆的階段。而caspase-3是caspase家族成員中最重要的效應(yīng)型[6]。本研究結(jié)果顯示，鹽霉素對(duì)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞生長不僅具有劑量依賴性抑制作用，而且使ΔΨm下降、細(xì)胞色素C和Ca2+的釋放，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧，以及增加caspase-3、8和9酶活性，并使Bcl-2/Bax 比值顯著降低；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡明顯增加。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明鹽霉素通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人肺腺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP凋亡。另外，鹽霉素也減少A549/DDP細(xì)胞內(nèi)β-catenin和p-LRP6蛋白水平。Wnt信號(hào)途徑對(duì)維持細(xì)胞生物學(xué)活性具有重要作用。最近研究顯示W(wǎng)nt信號(hào)途徑與腫瘤干細(xì)胞增殖與自我復(fù)制及其耐藥密切相關(guān)[7-9]。所以，結(jié)果說明鹽霉素通過抑制Wnt信號(hào)途徑抑制A549/DDP細(xì)胞增殖。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于改善肺腺癌臨床治療方法提供新的依據(jù)。但如何應(yīng)用鹽霉素于肺腺癌臨床治療還有待進(jìn)一步研究。

[1] Gupta PB, Onder TT, Jiang G, et al. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J]. Cell,2009,138(4):645-659.

[2] Korsmeyer SJ，Shutter JR，Veisd J，et al． Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J]． Semin Cancer Biol，1993，4(6):327-332.

[3] Lalier L, Cartron PF, Juin P, et al. Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J]. Apoptosis, 2008,12(5): 887-896.

[4] Lindsay J，Esposti MD，Gilmore AP． Bcl-2 proteins and mitochondria-specificity in membrane targeting for death [J]． Biochim Biophys Acta，2011，1813(4):532-539．

[5] 趙艷芝，張冬梅，于剛剛,等.缺氧后處理中CYP2J3/EETs系統(tǒng)對(duì)心肌凋亡的影響 [J].中國病理生理雜志，2011，27(6)：1132-1137.

[6] Vidal A, Koff A. Cell-cycle inhibitors: three families united by a common cause[J]. Gene,2000,247(1-2):1-15.

[7] Corbin AS, Agarwal A, Loriaux M, et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity[J]. J Clin Invest, 2011,121(1):396-409.

[8] Lu D, Choi MY, Yu J, et al. Salinomycin inhibits Wnt signaling and selectively induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(32):13253-13257.

[9] Wang Y, Krivtsov AV, Sinha AU, et al. The Wnt/β-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML[J]. Science, 2010,327(5973):1650-1653.

Salinomycininhibitedproliferationandinducedapoptosisofcisplatin-resistanthumanlungadenocarcinomacelllineA549/DDP

ZENG Jia1, LIU Cheng-chen2, ZHU Ai-zhen2, CHEN Xiao-yu2, TAN Guang-xiao2, LIU Ge-xiu2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ChinesePLA411Hospital,Shanghai200081,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of salinomycin on the proliferation and apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP.METHODSThe inhibitory effect of salinomycin on the growth of A549/DDP cells was tested by MTT methodinvitro. The apoptosis and mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of A549/DDP cells were assayed by flow cytometry. The activity of caspase-3, 8 and 9 was determined by the method of colorimetry. The levels of cytochrome C, Bcl- 2, Bax, β-catenin, and phosphorylated low-density lipoprotein receptor-related protein 6(p-LRP6) were measured by Western blotting.RESULTSSalinomycin inhibited the growth of A549/DDP cells in a dose-dependent manner. Salinomycin at concentration of 0.2 μmol/L decreased ΔΨmlevel, and increased reactive oxygen species (ROS), cytochrome C and cytosolic Ca2+release in the cells. Salinomycin also increased the acti-vity of caspase-3, 8, and 9 in the cells, reduced the ratio of Bcl-2/Bax, and decreased the levels of β-catenin and p-LRP6.CONCLUSIONSalinomycin depresses the cell growth by inhibiting Wnt signaling, and induces the apoptosis of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/DDP via mitochondria-dependent and Bcl-2/Bax pathways.

Salinomycin; Lung neoplasms; Cisplatin; Apoptosis; β-catenin; Low-density lipoprotein receptor-related protein 6

R743

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.012