冠心病危重病人紅細胞流變特性和血紅蛋白結構的研究*

郝希平， 岳糧躍， 雷健明， 李周璇， 楊繼旺， 侯增濤， 黃耀熊△

(1暨南大學生物醫學工程研究所，廣東 廣州 510632；2河南科技大學物理與工程學院,洛陽市光電功能材料重點實驗室，河南 洛陽 471003；3廣西醫科大學物理學教研室，廣西 南寧 530021)

1000-4718(2012)05-0937-05

2011-09-13

2012-03-09

國家自然科學基金資助項目(No.30940019)

△通訊作者 Tel:020-85220469; E-mail: tyxhuang@jnu.edu.cn

冠心病危重病人紅細胞流變特性和血紅蛋白結構的研究*

郝希平1,2， 岳糧躍3， 雷健明1， 李周璇1， 楊繼旺1， 侯增濤1， 黃耀熊1△

(1暨南大學生物醫學工程研究所，廣東 廣州 510632；2河南科技大學物理與工程學院,洛陽市光電功能材料重點實驗室，河南 洛陽 471003；3廣西醫科大學物理學教研室，廣西 南寧 530021)

目的研究冠心病危重病人紅細胞流變特性和血紅蛋白結構的變化。方法利用動、靜態圖像分析技術和紫外-可見光譜技術，對pH 7.4生理環境下冠心病危重病人和健康人的紅細胞和離體血紅蛋白進行測定。結果(1)冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞的形態大小參數與健康人不同，冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞的接觸面積、周長、長軸和短軸比健康人小，形狀歸化因子比健康人大。(2)冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞的彎曲彈性模量比健康人大。(3)冠心病危重病人血紅蛋白的吸收光譜與健康人一致，吸收峰的位置相同，吸收峰的吸收值沒有明顯差異。結論冠心病危重病人青齡、老齡紅細胞的形態結構均不同程度向球形過渡，變形能力比健康人下降，但其血紅蛋白結構未呈現與健康人不同的變化。

冠狀動脈疾病； 紅細胞； 血紅蛋白

紅細胞在體內的主要功能是運輸氧氣和二氧化碳，即把氧氣從肺部攜帶到全身組織并把二氧化碳從組織攜帶到肺部排出體外。這一功能的正常發揮主要取決于兩個因素：一是細胞內血紅蛋白(hemoglobin, Hb)是否具有正常的構型并具有完善的攜氧能力；二是細胞是否有合適的雙凹形結構，并具有較好的變形能力使之可適應流場，便于通過包括毛細血管在內的各種血管到達全身各個組織器官。也就是說，紅細胞的這一功能與其形態、細胞膜力學特性以及細胞內Hb的結構和功能密切相關。

人們十分重視研究不同條件對健康人紅細胞及血紅蛋白的作用[1-4]，我們之前研究了在pH 8.0時危重病人的血紅蛋白的結構變化[5]，但至今沒見研究報道冠心病危重病人的紅細胞力學特性及血紅蛋白的結構和功能情況。鑒于此，本文將探討冠心病危重病人在pH 7.4正常生理環境下紅細胞及血紅蛋白的變化，這對臨床診斷和治療具有極大意義。

材 料 和 方 法

1材料

經倫理委員會批準并送達知情同意書情況下，分別取冠心病住院危重病人及健康成人的化驗靜脈血6例，肝素鈉抗凝。6個病例中：(1)女，49歲，為冠狀動脈粥樣硬化心臟病、尖端扭轉型室性心動過速，合并多發性腦梗塞；(2)女，63歲，為冠狀動脈粥樣硬化心臟病、急性前壁心肌梗死，合并肺部感染；(3)女，54歲，為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，心功能Ⅳ級，合并甲狀腺功能亢進；(4)女，87歲，為冠狀動脈粥樣硬化心臟病、心功能Ⅲ級，合并原發性高血壓Ⅲ級；(5)女，56歲，為冠狀動脈粥樣硬化心臟病，心功能Ⅲ級，合并重癥高血壓Ⅲ級；(6)男，61歲，為冠狀動脈粥樣硬化心臟病急性ST段抬高型心肌梗死，合并肺部感染。所有這些病人取血前都沒有吸氧及均臨床診斷為危重病人須進行有關監護室處理。健康成人6例血樣，分別編號㊣1、㊣2、㊣3、㊣4、㊣5和㊣6作對照組。

2方法

2.1青齡、老齡紅細胞流變特性的測定

2.1.1Percoll不連續密度梯度液的制備 紅細胞的平均壽命為120 d，紅細胞在其生存期內青齡、老齡紅細胞的形態結構和變形能力有所差異。紅細胞在衰老過程中，其表面積和體積會逐漸減少，但不改變胞內血紅蛋白的量，所以隨著紅細胞老化，細胞的密度會逐漸變大。本文分離青齡、老齡紅細胞采用的方法是Percoll密度梯度分離法[6]。

① 配制SA緩沖溶液 將三蒸水與配好的HBS溶液以體積比19∶1混合好，再加入適量牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)。

② 配制SB緩沖溶液 將Percoll液與HBS溶液以體積比19:1混合好，再加入適量BSA。

③ 配制PBS-BSA溶液 pH 7.4 PBS緩沖液，加入5 mmol/L 葡萄糖，1 mmol/L MgSO4，1 g/L BSA。

④ 將上述配好的溶液SA和SB按不同比例配成密度為1 063.61～1 081.44 g/L的5個點并形成密度梯度。然后依次按溶液5～1的順序用移液槍向12 mL離心管沿管壁緩慢加入，這樣不連續密度梯度液制備完畢。

2.1.2青齡、老齡紅細胞的制備 取1 mL全血，放入離心機中以3 000 r/min離心3 min, 然后將血清和白膜層吸走，留下紅細胞。再加入1 mL SA溶液與紅細胞混勻，放入離心機中以3 000 r/min離心3 min，再吸走上層溶液留下紅細胞，重復3次。最后將洗凈的紅細胞與SA溶液以體積比4∶6的比例混勻，然后將混合液加入準備好的梯度液中。最后放入離心機中以3 000 r/min離心20 min，上述操作均在24 ℃下完成。

健康人紅細胞可分為4個條帶，冠心病人紅細胞的4條帶界面不清，故取最上層命名為Y(青齡)，最下層命名為O(老齡)，進行對照研究。

提取的各層紅細胞，放入細胞緩沖液中，3 000 r/min離心清洗2次，充分去除殘留的Percoll分離液，再用細胞緩沖液重懸至原來的體積。觀察紅細胞時，先將紅細胞懸液離心，取下層的紅細胞稀釋2 000倍用于紅細胞形態結構的觀察，稀釋200 000倍用于變形能力的分析。上述稀釋均用PBS-BSA液。

2.1.3青齡、老齡紅細胞形態、變形能力的測定 用本實驗室自行發展的多維顯微圖像分析技術，多維顯微圖像分析系統的基本結構如圖1所示。

將制備好的紅細胞樣品置于Nikon TE300倒置顯微鏡下，顯微鏡鹵鎢穩流光源(100 W)光束通過孔徑大小可調的光柵后，經聚焦透鏡照射到樣品上，其對應孔像直徑在1 μm至200 μm范圍可調。物鏡收集的樣品透射光通過半透半反鏡后，通過顯微生物醫學圖像分析系統，PCO 1600高分辨率制冷型CCD(Cooke)，攝取顯微鏡觀測到的樣品圖像，再利用圖像捕捉卡和計算機實現圖像的顯示、存儲。

本文利用該技術拍攝活態紅細胞白光下的顯微圖像，拍攝選用×40物鏡，CCD的放大倍數為×20，得到的紅細胞圖像實際的放大倍數為×800。

Figure 1. Multidimensional microscopic image analysis system.

圖1多維顯微圖像分析系統

2.1.4紅細胞形態顯微靜態圖像分析

(1)空間定標，通過測量標準測微尺的相關參數，求得在顯微鏡成像系統中所測的尺度大小和標準測微尺實際長度的比例關系。(2)拍攝具有合適對比度的紅細胞顯微圖像，見圖2，輸入顯微靜態圖像分析系統。(3)使用閉值分割技術并進行二值化處理，對紅細胞邊緣進行檢測和分割。(4)計算每個紅細胞的接觸面積、周長、長軸、短軸、形狀歸化因子等幾何參數。接觸面積、周長、長軸、短軸、形狀歸化因子等是定量反映紅細胞形態和大小的重要參數。其中形狀歸化因子(roundness facotr,REF)反映紅細胞的幾何形態，其值在0～1之間，越接近于1表示紅細胞越接近圓形，其值等于1表示紅細胞為圓形，其值小于1表示紅細胞為非圓形。

Figure 2. Static image of red blood cells.

圖2紅細胞靜態圖像

將拍攝的紅細胞形態圖像導入顯微靜態圖像分析軟件，按照操作步驟，利用該軟件測量分析不同條件下紅細胞形態和大小的參數。每個條件下測量分析180個紅細胞，取其平均值。

2.1.5紅細胞的顯微動態圖像分析

(1)用倒置相差顯微鏡，通過專用圖像攝錄系統攝錄帶Flicker光暈的單個活態紅細胞的動態圖像，見圖3。(2)設定亮度域值，在暈邊緣的最上、最下、最左、最右4個方向規定4個等域值點。(3)對動態連續拍攝的圖像進行自動分析，分析程序自動繪出2個垂直方向和2個水平方向的波動曲線。(4)求得細胞膜的各種力學參量。其中包括紅細胞膜彎曲彈性模量Kc(表征細胞膜變形能力)。Kc值越小表明細胞膜的變形能力越好，細胞的生理特性越佳；反之，值越大表明細胞膜的變形能力越差，細胞越容易破裂。

Figure 3. The dynamic image of red blood cells.

圖3紅細胞動態圖像

攝錄紅細胞的動態變化圖像，每個錄像需要攝錄至少60幀，攝錄的畫面要保證每幅畫面僅有1個細胞，以免影響后面的分析過程。將攝錄的反映紅細胞動態變化的錄像導入顯微動態圖像分析軟件，按照操作步驟，測量分析單個活態紅細胞的Kc值，每個條件下測量分析180個紅細胞，取其平均值。

2.2胞內血紅蛋白結構的測定

2.2.1pH 7.4緩沖液的制備 分別稱取71.6 g Na2HPO4·H2O、31.21 g NaH2PO4·H2O溶解在1 000 mL的雙蒸去離子水中，分別配置20 mmol/L的 Na2HPO4和NaH2PO4溶液；調節Na2HPO4和NaH2PO4溶液的比例，配置成pH 7.4的緩沖液。緩沖液再用0.2 μm過濾器過濾，保證緩沖液無塵。

2.2.2血紅蛋白的制備 分別取各樣品全血1.5 mL，1 500 r/min離心10 min，去除上層血漿和脂質體。紅細胞用0.9%氯化鈉清洗3次，2 000 r/min離心10 min去除上清液。將洗后的紅細胞放入4 ℃冰箱預冷15 min后，加入10倍體積的冰水，劇烈搖晃使紅細胞破裂，4 ℃冰箱保存20 min，再4 ℃、12 000 r/min離心60 min，抽取上層紅細胞的溶血物，將其用0.22的一次性過濾器過濾純化，得到血紅蛋白的粗提液。粗提液再經葡聚糖G-25過柱純化，得到純化的血紅蛋白。純化后的血紅蛋白放入4 ℃冰箱保存備用。

通過測量540 nm吸收光譜的吸光值得到血紅蛋白的濃度。提純后的血紅蛋白分別用之前配好的pH 7.4值的磷酸緩沖液稀釋，以100 μL血樣，加2.5 mL緩沖液[7]，制備紫外-可見光檢測樣品。

2.2.3血紅蛋白的紫外-可見光譜測定 采用熱電公司的UNICAM UV500型紫外-可見光譜儀，測量波長范圍為350～700 nm，波長精度為±0.1 nm，對各樣品檢測。

3統計學處理

結 果

1冠心病危重病人青齡、老齡紅細胞的形態大小

由表1可知，在pH 7.4環境下冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞接觸面積、周長、長軸、短軸比健康人小，形狀歸化因子REF比健康人大，形態大小參數有顯著差異(P<0.01)。

表1冠心病危重病人與健康人青齡、老齡紅細胞的形態參數

GroupContactarea(μm2)Perimeter(μm)Longaxis(μm)Shortaxis(μm)REFYp39.31±3.29**22.66±1.11**7.15±0.48**6.40±0.33**0.86±0.02**Yh44.99±4.5525.01±2.158.35±0.647.01±0.470.66±0.05Op33.38±1.0220.62±0.32△△6.80±0.14△△5.52±0.18△△0.89±0.02△△Oh40.32±9.9621.97±2.087.62±0.546.43±0.560.76±0.07

REF:roundness factor.**P<0.01vsYh，△△P<0.01vsOh.

2冠心病危重病人紅細胞的彎曲彈性模量Kc

從表2可見，冠心病危重病人的紅細胞的彎曲彈性模量Kc比健康人大，二者有顯著差異(P< 0.01)。

冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞接觸面積、周長、長軸、短軸均比健康人小，而REF和Kc比健康人大，說明冠心病危重病人的紅細胞已從雙凹圓盤形向球形轉變，變形能力變差，這與文獻[8-9]結論一致。

表2冠心病危重病人與健康人青齡、老齡紅細胞彎曲彈性模量Kc

GroupKc(×10-19J)Yp2.31±0.35**Yh1.51±0.23Op3.51±0.29△△Op2.33±0.27

**P<0.01vsYh;△△P<0.01vsOh.

3pH7.4環境下血紅蛋白的紫外-可見光譜

圖4是用UV500紫外-可見光譜儀測定的在pH 7.4情況下冠心病危重病人與健康人㊣1血紅蛋白的吸收光譜，(圖中只畫出正常人㊣1的吸收光譜，其它㊣2-㊣6的吸收光譜與其一致)。415 nm是血紅素的吸收峰，542 nm和577 nm分別是氧合血紅蛋白的β和α吸收峰，它們反映氧合血紅蛋白的攜氧能力。

從圖4 可見，在pH 7.4環境下危重病人血紅素的吸收峰415 nm、氧合血紅蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm，均與健康人血紅蛋白對應的位置沒什么不同。

pH 7.4下冠心病危重病人與健康人血紅素的吸收峰415 nm、氧合血紅蛋白的β吸收峰542 nm和α吸收峰577 nm的吸光度值(A)在表3中給出。由于血紅素、氧合血紅蛋白的濃度與吸光度值呈正比，故表3提示，在pH 7.4環境下冠心病危重病人的血紅素和氧合血紅蛋白的濃度與健康人沒有顯著差異(P>0.05)。

冠心病危重病人與健康人在pH 7.4生理壞境下血紅蛋白的吸收光譜完全一致，吸收峰的位置相同且吸光度值沒有明顯差異，說明其血紅蛋白的結構沒有改變。

Figure 4. The Hb absorption spectra of critically ill patients with coronary heart disease(①～⑥) and healthy people(㊣1).

圖4冠心病危重病人與健康人血紅蛋白的吸收光譜

表3pH7.4下冠心病危重病人與健康人血紅蛋白的吸光度值

GroupA415A542A577Hb10.7870±0.04100.0899±0.00630.0998±0.0068Hb20.7350±0.04000.0800±0.00110.0953±0.0011

討 論

紅細胞功能的發揮決定于紅細胞的幾何形狀、變形能力及其胞內血紅蛋白的結構功能。本研究發現在pH 7.4環境下冠心病危重病人的青齡、老齡紅細胞接觸面積、周長、長軸、短軸均比健康人小，形狀歸化因子REF比健康人大，說明其紅細胞的形狀已發生了變化，特別是形狀歸化因子REF提示其已從雙凹形結構轉化為近球型。這種形態變化會影響其變形能力，所以其彎曲彈性模量Kc比健康人大，正進一步說明了這一點。其原因可能是由于：(1)冠心病患者膜膽固醇含量增高及過氧化脂質在體內積聚，影響了紅細胞膜結構；(2)由于體內氧分壓相對較低，膜表面ATP濃度降低，對鈣泵的作用就會降低和消失，使細胞內鈣潴留，影響了紅細胞變形能力；(3)由于心肌缺血后組織缺氧，造成氧自由基大量釋放及酸中毒，加重了紅細胞膜的損害，從而使紅細胞變形能力急劇下降。

但是，本研究發現冠心病危重病人與健康人在pH 7.4生理環境下血紅蛋白的吸收光譜基本一致，各吸收峰的位置相同且吸光度沒有明顯差異，提示冠心病人盡管其紅細胞已發生了形態變化，但仍沒有影響到胞內，血紅蛋白的結構基本沒有改變。由于吸收譜反映的血紅蛋白結構信息還比較粗，冠心病危重病人血紅蛋白各級結構更為詳盡細微的信息，還需要采用像拉曼散射譜等手段作進一步深入的研究，以得出更加準確全面的結果。

本研究揭示了冠心病危重病人的紅細胞形態結構及變形能力、血紅蛋白吸收譜等參數與健康人的異同，這些工作，對心血管疾病的治療及紅細胞的病理生理研究具有指導作用。

[1] Gedde MM, Yang E, Huestis WH. Resolution of the paradox of red cell shape changes in low and high pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1417(2): 246-253.

[2] Rasia M, Bollini A. Red blood cell shape as a function of medium’s ionic strength and pH[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1372(2): 198-204.

[3] 姚成燦，李校坤，黃耀熊. 溫度對單個活態人紅細胞攜氧能力的即時影響[J]. 光譜學與光譜分析，2005,25(4):613-616.

[4] 吳正潔.酸、堿pH環境對人紅細胞和血紅蛋白的作用[D]. 廣州:暨南大學, 2010.

[5] Hao X, Yue L, Lei J,et al. Effect of alkaline pH on size of hemoglobin from critically ill patient[C]∥Proceedings of 2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology,Biophysics and Bioengineering (CMBB),2010:452-454.

[6] Rennie CM, Thompson S, Parker AC,et al. Human erythrocyte fraction in “Percoll” density gradients[J]. Clin Chim Acta,1979, 98(1-2): 119-125.

[7] Adachi K, Asakura T. Aggregation and crystallization of hemoglobin A, S, and C.Probable formation of different nuclei for gelation and crystallization [J]. J Biol Chem, 1981, 256(4):1824-1830.

[8] 王紅勇，何作云，李希楷.冠心病患者全血黏彈性的變化[J]. 中國動脈硬化雜志,2002,10(3): 236-238.

[9] 張苗青，李溫娘.普拉固對冠心病合并高脂血癥患者血脂及血液流變學的影響[J].中國病理生理雜志，1997,13(4)：391-392.

Rheologicalpropertiesandhemoglobinstructureofredbloodcellsincri-ticallyillpatientswithcoronaryheartdisease

HAO Xi-ping1, 2, YUE Liang-yue3, LEI Jian-ming1, LI Zhou-xuan1, YANG Ji-wang1, HOU Zeng-tao1, HUANG Yao-xiong1

(1InstituteofBiomedicalEngineering,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2LuoyangKeyLaboratoryofPhotoelectricalFunctionMaterials,SchoolofPhysicsandEngineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;3DepartmentofPhysics,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:tyxhuang@jnu.edu.cn)

AIM: To study the rheological properties of red blood cells (RBC) and the structure of hemoglobin in critically ill patients with coronary heart disease.METHODSAt pH 7.4, the rheological properties of RBC and the structure of hemoglobin isolated from critically ill patients with coronary heart disease and from healthy people were studied with both static and dynamic imaging techniques and ultraviolet-visible spectroscopy.RESULTSThe rheological properties of RBC from the critically ill patients with coronary heart disease were significantly different from those of healthy people. The bending modulus, which indicates the rigidity of RBC, was greater in the patients than that in healthy people. The absorption spectra of the hemoglobin of critically ill patients with coronary heart disease were almost the same as those of healthy people.CONCLUSIONThe morphology and flexibility of RBC in critically ill patients with coronary heart disease are worse than those in healthy people, whereas the structure of hemoglobin in the patients is basically found no difference from that in healthy people.

Coronary disease; Erythrocytes; Hemoglobin

Q657.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.05.031