干擾鹽皮質激素受體基因對RAW 264.7細胞增殖和凋亡的影響*

姬文婕， 胡道川， 陳雪芬， 馬永強， 盧芮伊， 周 欣， 魏路清

(中國人民武裝警察部隊后勤學院 1附屬醫院呼吸與重癥醫學科, 2武警部隊心血管病研究所，天津 300162)

1000-4718(2012)12-2261-05

2012-06-28

2012-09-29

國家自然科學基金資助項目(No. 81102088)；天津市自然科學基金一般項目(No. 12JCYBJC16600)；武警醫學院科研項目(No.WYB201108)

△通訊作者 Tel: 022-24716466; E-mail: wenjieji@gmail.com

干擾鹽皮質激素受體基因對RAW 264.7細胞增殖和凋亡的影響*

姬文婕1△， 胡道川1， 陳雪芬1， 馬永強1， 盧芮伊2， 周 欣2， 魏路清1

(中國人民武裝警察部隊后勤學院1附屬醫院呼吸與重癥醫學科,2武警部隊心血管病研究所，天津 300162)

目的應用RNA干擾技術沉默小鼠RAW 264.7巨噬細胞鹽皮質激素受體(MR)基因，建立穩定干擾細胞株，并觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。方法針對MR基因設計合成重組MRshRNA質粒，脂質體法轉染質粒至RAW 264.7細胞，經G418篩選后獲得穩定表達細胞株。細胞分為3組：野生型(WT)組、陰性對照(NC)組和干擾(shMR)組。熒光顯微鏡下觀察確定細胞的轉染效率；實時定量PCR法檢測細胞中MR mRNA的表達；CCK-8方法檢測細胞增殖活性；流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況。結果(1)MRshRNA能明顯抑制RAW 264.7細胞的MR基因表達，抑制率70%以上。(2) 從第3 d開始，shMR組細胞的生長速度明顯低于NC和WT組 (P<0.05)，說明MRshRNA能明顯抑制細胞增殖。(3) WT、NC和shMR組的增殖指數分別為(37.2±0.5)%、(37.5±1.6)%和(31.0±1.3)%，shMR組的細胞周期出現改變，S期和G2/M期比例明顯下降，增殖指數下降(P<0.05)。(4) WT、NC和shMR組的細胞凋亡率分別為(2.18±0.36)%、(6.65±0.81)%和(7.70±1.34)%，shMR組略高于NC組，但二者的差異無統計學意義(P>0.05)。結論本研究成功構建了穩定干擾MR基因表達的RAW 264.7細胞株，MRshRNA能夠明顯抑制RAW 264.7細胞增殖，但對其凋亡無明顯影響。

受體,鹽皮質激素； RNA干擾； RAW 264.7細胞； 細胞增殖； 細胞凋亡

巨噬細胞是具有多功能的異質性細胞群體，在體內具有抵抗微生物侵犯，參與免疫應答以及其它炎癥疾病的作用。不同的環境中，巨噬細胞可以具有不同的活化類型，發揮不同的功能，繼而影響相關病理生理過程。近年來研究發現鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)參與了巨噬細胞的活化表型調節[1]，而且MR受體拮抗劑亦可改善自發高血壓大鼠的心肌纖維化程度以及減輕實驗性肺纖維化等[2-3]。因此本研究采用RNA干擾技術，構建穩定干擾MR基因的小鼠RAW 264.7巨噬細胞，觀察對其增殖和凋亡等生物學特性的影響，從而為進一步探討MR在巨噬細胞相關的病理生理學過程的調控機制提供有力的分子生物學工具。

材 料 和 方 法

1材料

小鼠巨噬細胞株RAW 264.7由南開大學生命科學院韓際宏教授惠贈；shRNA干擾表達載體系統購自上海吉瑪制藥技術有限公司；高糖DMEM液體培養基和胎牛血清購自HyClone；G-418購自Amesco；OPTI MEM轉染培養基、LipofectamineTM2000和TRIzol購自Invitrogen；CCK-8試劑盒購自Dojindo；MMLV反轉錄酶和dNTPs購自Promega；SYBR Green實時定量PCR試劑盒購自Roche；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自Biolegend。

2主要方法

2.1shRNA表達質粒的構建 設計合成4對針對小鼠MR基因序列(Gene ID：110784)的shRNA序列，以與目的基因shRNA序列和任何小鼠基因序列無同源性的序列為陰性對照。所有序列經BLAST分析與已知的小鼠基因序列無同源性。將有短發夾結構的寡核苷酸序列，克隆到空載體pGPU6/GFP/Neo，構建shRNA重組質粒。shRNA質粒靶位點及序列見表1。

表1 MR shRNA重組質粒靶位點及靶序列

2.2細胞轉染和干擾位點的篩選 小鼠巨噬細胞株RAW 264.7用高糖DMEM培養基(含12%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞用于實驗。將重組質粒按照LipofectamineTM2000說明書轉染細胞，主要步驟如下：取對數生長期RAW 264.7細胞計數后接種于6孔板，每孔4×105個，使轉染時達到80%～90%的融合；將4個不同干擾位點質粒(表1)和陰性質粒分別轉染RAW 264.7，空白對照組以完全培養基代替轉染復合物；轉染24 h后用熒光顯微鏡觀察各組細胞的熒光比例，確定轉染效率。TRIzol法提取細胞總RNA，實時定量PCR法檢測MR mRNA的表達量，篩選出干擾效率最高的重組質粒進行后續實驗。

2.3穩定細胞株的建立 細胞培養、接種及轉染步驟同2.2，用2.2篩選出的靶位點作為有效干擾位點。細胞分為3組：野生型(wild type，WT)組、陰性對照(negative control，NC)組和干擾(RNA interference byMRshRNA，shMR)組。轉染36 h后，用G418(500 mg/L)篩選轉染細胞，然后挑取單克隆進行擴大培養，傳代3次后，用熒光顯微鏡觀察細胞熒光有無丟失，RT-PCR法檢測MR基因干擾效果，若細胞狀態穩定，則表明穩定轉染細胞系RAW 264.7-shMR和RAW 264.7-NC構建成功。

2.4實時定量PCR法檢測細胞中MR mRNA的表達水平 按照TRIzol說明書提取各組細胞的總RNA，反轉錄成cDNA，然后用SYBR Green法進行實時定量PCR檢測，同一樣本設2個復孔，實驗重復3次。MR上游引物5’-GGCTACCACAGTCTCCCTGA-3’，下游引物5’-AGAACGCTCCAAGGTCTGAG-3’；內參照β-actin上游引物5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游引物5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’。以上引物均由北京三博遠志生物技術有限公司合成。反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min)40個循環，標準熔解曲線分析。用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，其中ΔΔCt=實驗組(Ct目的基因-Ct內參照基因)-對照組(Ct的基因-Ct內參照基因)。

2.5CCK-8法測定細胞增殖活性 分別將對數生長期的shMR、NC和WT組細胞計數后，接種于96孔板，每孔1×103個，每組設6個復孔，分別于培養1 d、2 d、3 d、4 d和5 d后，每孔加入CCK-8 10 μL，繼續培養4 h后，測定450 nm波長處吸光度值(A)，實驗重復3次，計算平均值。根據各組細胞每天的A值繪制細胞生長曲線，并計算生長抑制率(inhibitory rate，IR)公式如下：

2.6細胞周期的測定 取各組對數生長期細胞，制備成單細胞懸液，用70%乙醇固定，PBS洗滌，加入PI染液(含50 mg/L PI、0.05%Triton X-100和100 mg/L RNase)，37 ℃孵育40 min，尼龍濾網過濾后，用Beckman Coulter FC500流式細胞儀測定細胞DNA含量，并用FlowJo軟件進行分析，實驗重復3次，計算平均值。增殖指數(proliferation index，PI)公式如下：

2.7細胞凋亡的檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，按照試劑盒說明進行操作。收集各組對數生長期細胞，Binding Buffer重懸細胞；加入10 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，室溫避光反應15 min，流式細胞儀進行檢測。重復測定3次，計算各組細胞的平均凋亡率。

3統計學處理

結 果

1MRshRNA干擾穩定細胞株的建立

在熒光顯微鏡下觀察，轉染24 h后各組細胞均轉染成功，轉染效率約為75%左右,見圖1。Real-time PCR結果顯示(圖2)，與NC組相比，不同干擾位點的shRNA組的MR mRNA水平的表達均降低(P<0.05)，其中MR-mus-2373的干擾效果最明顯，抑制率為70%左右。因此，選用重組質粒pGPU6/GFP/Neo-MR-2373構建穩定干擾細胞株。將上述質粒及陰性質粒分別轉染細胞，經G418抗性篩選獲得穩定表達GFP的細胞，連續傳3代后，經real-time PCR檢測，RAW 264.7-shMR細胞的MR mRNA的抑制率仍在70%以上，說明成功構建了穩定干擾細胞株。

Figure 1. Fluorescent images of RAW 264.7 cells after transfection with recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo (×400).A: blank control; B: shRNA transfection.

圖1熒光顯微鏡下觀察轉染效率

圖2shRNA轉染后RAW264.7細胞中MRmRNA的表達

2MRshRNA對RAW264.7細胞增殖活性的影響

從各組細胞的生長曲線可以看出，從第3 d開始，shMR組細胞的生長速度明顯低于NC和WT組 (P<0.05)，而后者之間無顯著差異,見圖3，說明MRshRNA能明顯抑制細胞增殖。與NC相比，shMR組細胞的第3 d生長抑制率為25.92%，第4 d為37.58%，第5 d為42.09%。

圖3MRshRNA對RAW264.7細胞增殖活性的影響

3MRshRNA對RAW264.7細胞周期的影響

WT、NC和shMR組的增殖指數分別為(37.2±0.5)%、(37.5±1.6)%和(31.0±1.3)%，見圖4。與WT和NC組相比，shMR組的細胞周期出現改變，S期和G2/M期比例明顯下降，增殖指數下降，差異有統計學意義；而NC與WT組的細胞周期分布無明顯差異。

Figure 4. Cell cycle of RAW 264.7 cells assayed by flow cytometry.

圖4流式細胞術檢測MRshRNA對RAW264.7細胞細胞周期的影響

4MRshRNA對RAW264.7細胞凋亡的影響

WT、NC和shMR組的細胞凋亡率分別為(2.18±0.36)%、(6.65±0.81)%和(7.70±1.34)%，NC較WT組的細胞凋亡率有明顯上升(P<0.05)，shMR組略高于NC組，但二者的差異無統計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5流式細胞術檢測MRshRNA對RAW264.7細胞凋亡的影響

討 論

巨噬細胞是具有吞噬、抗原遞呈和免疫調節等功能的免疫細胞，在各種不同的刺激下，巨噬細胞會表現出不同的功能：促進炎癥與抑制炎癥、免疫應答與免疫耐受、組織損傷與組織修復等。在不同環境中，巨噬細胞可以發生不同性質的活化，成為具有不同分子表型和功能特征的亞群，從而決定了其在各種環境和不同疾病中發揮的作用[4]。目前認為巨噬細胞至少存在2種活化狀態，即經典活化(classical activation, M1)和替代活化(alternative activation, M2)[5]。M1巨噬細胞通常認為是經干擾素γ激活，主要表現為促進炎癥(分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子)和氧化應激反應(誘導型一氧化氮合酶表達上調)、增強的吞噬活性；M2巨噬細胞主要經IL-4和IL-13激活，主要表現為抑制炎癥反應，并與組織的修復和纖維化過程有關(分泌多種生長因子)。2種狀態的平衡對于機體維持正常免疫功能是必須的，任何一種活化失衡狀態都可能對組織炎癥的恢復產生不良影響。

鹽皮質激素受體是一種典型的胞核甾體類激素受體，它的經典配體為醛固酮，與細胞的增殖、分化和凋亡等病理生理過程有密切聯系[6-8]。傳統觀點認為MR主要存在于心血管系統和腎臟相應的靶細胞，但是新近研究發現單核-巨噬細胞也存在這類受體，并且參與了對巨噬細胞表型的調控，即鹽皮質激素受體活化(如與醛固酮結合)可使巨噬細胞向M1分化，而鹽皮質激素受體被拮抗(如與螺內酯結合)則可使巨噬細胞向M2分化[1]。選擇性敲除巨噬細胞MR基因后，鹽皮質激素依賴性心臟纖維化、炎癥以及高血壓等明顯減輕[9-10]。肺巨噬細胞數量和功能的動態演變在時間和空間上均與肺纖維化病程和病情密切相關，增殖和凋亡是調節巨噬細胞數量的重要機制，研究發現實驗性肺纖維化模型中，急性炎癥期呈現肺泡巨噬細胞增殖明顯，數量增多，而在纖維化期，則出現巨噬細胞凋亡增加，數量減少[11]。因此，通過對MR的調控，改變巨噬細胞活化狀態，調節巨噬細胞數量功能，有可能達到有效的抗炎效果，從而改變疾病的預后和轉歸。

本研究中采用基于質粒載體的shRNA系統，用脂質體將重組質粒pGPU6/GFP/Neo-MRshRNA轉染至RAW 264.7細胞，經過G418抗性篩選后獲得穩定表達細胞株。實驗結果表明MRshRNA有效地抑制了RAW 264.7 細胞中MR mRNA的表達，明顯地抑制了RAW 264.7細胞的生長，S期和G2/M期比例明顯下降，而對細胞的凋亡基本沒有影響。但是目前尚未闡明MR對巨噬細胞表型調控的機制與其它信號轉導通路之間的相互關系，以及在一些疾病發生發展過程中的意義等。因此，本實驗中成功構建的穩定干擾細胞株將為進一步探討巨噬細胞MR的病理生理學機制提供有力的研究工具和奠定初步的實驗基礎。

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EffectofmineralocorticoidreceptorgenesilencingbyRNAinterferenceonproliferationandapoptosisofmurinemacrophagecelllineRAW264.7

JI Wen-jie1, HU Dao-chuan1, CHEN Xue-fen1, MA Yong-qiang1, LU Rui-yi2, ZHOU Xin2, WEI LU-qing1

(1DepartmentofRespirologyandCriticalCareMedicine,AffiliatedHospital,2ArmedPoliceForcesInstituteforCardiovascularDiseases,LogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:wenjieji@gmail.com)

AIM: To establish stable knockdown of mineralocorticoid receptor (MR) expression through short hairpin RNA (shRNA)-mediated silencing in murine RAW 264.7 macrophages.METHODSStableMRsilencing in RAW 264.7 cells was achieved by recombinant shRNA plasmid targeting murineMRgene via liposome-mediated transfection, followed by G418 selection. The efficacies of plasmid transfection andMRsilencing in G418-resistant cells were verified by immunofluorescent microcopy and real-time PCR, respectively. Proliferative activity ofMR-silencing cell line was analyzed by CCK-8 assay. Cell cycle and apoptosis were evaluated by flow cytometry.RESULTSMRgene expression was down-regulated by 70% compared with the negative control (NC) plasmid transfection. In addition,MR-silencing cells exhibited lower proliferative activity compared with NC and wide type RAW 264.7 cells (P<0.05), along with reduced proliferation index of 31.0%±1.3% (P<0.05), compared with the wide type cells (37.2%±0.5%) and the NC cells (37.5%±1.6%). In resting state, the apoptotic rate in wide type, NC andMR-silencing cells were 2.18%±0.36%, 6.65%±0.81% and 7.70%±1.34%, respectively, and no statistical difference was observed between NC andMR-silencing cells (P>0.05).CONCLUSIONMRgene silencing inhibits the proliferation of RAW 264.7 macrophages, but has no obvious effect on the apoptosis of the resting state cells.

Receptors,mineralocorticoid; RNA interference; RAW 264.7 cells; Cell proliferation; Apoptosis

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.027