腦內高表達microRNAs的時空效應及其在神經管缺陷中的可能作用*

白寶玲， 李會莉， 陳淑媛， 王曉蕾， 張 勤， 趙慧智， 張 霆

(首都兒科研究所， 北京 100020)

1000-4718(2012)12-2291-06

2012-07-16

2012-09-20

國家自然科學基金資助項目(No.31071133) ；北京市科委科技新星資助項目(No.2010B045)

△通訊作者 Tel: 010-85695585; E-mail: zhangtingcv@yahoo.com.cn

·綜述·

腦內高表達microRNAs的時空效應及其在神經管缺陷中的可能作用*

白寶玲， 李會莉， 陳淑媛， 王曉蕾， 張 勤， 趙慧智， 張 霆△

(首都兒科研究所， 北京 100020)

微小RNA(microRNA,miRNA)在生物體的發育生長、細胞增殖分化及凋亡、激素的分泌和腫瘤發生等領域中具有重要的調控功能[1-2]。哺乳動物中樞神經系統的發育過程需要經歷多個位點的神經管閉合，若神經管閉合失敗或早閉，會導致神經管缺陷(neural tube defects, NTD)的發生，這是一種嚴重的、多因素的先天性復雜疾病，以往文獻報道有多種miRNAs參與了NTD的發病機制。

1 神經管的形成以及NTD發生的機制

1.1神經管的發育形成 哺乳動物中，神經管閉合被認為是個不連續的過程，該閉合過程沿頭-尾軸類似于拉拉鏈的方式進行分段閉合，如小鼠胚胎中，閉合啟動大約在妊娠日(gestational day，GD)8.5 d，從閉合點1、2、3依次逐漸閉合[3-4]。但在人類胚胎中，缺乏閉合點2的形成，且約有80%小鼠胚胎在缺乏該位點后顱骨仍閉合完全[3,5]，因此推斷此閉合位點對腦的形成是非必需的。

神經管形成由細胞遷移、增殖、黏附、凋亡以及細胞融合和重塑等系列事件組成。研究證明，多條信號通路參與其中，如平面細胞極性(planar cell polarity,PCP)通路所驅動的匯聚延伸對閉合位點1的形成及閉合意義重大，Shh(Sonic hedgehog)通路則調控著神經褶中線鉸鏈位點(median hinge point,MHP)及背外側鉸鏈位點(dorsolateral hinge point,DLHP)的形成，Notch通路被認為參與了神經干細胞的自我修復和抑制神經元早熟等事件，另外，經典Wnt通路、肌醇代謝通路、維甲酸(retinoic acid, RA)代謝通路、信號轉導子和轉錄激活子通路(signal transducer and activator of transcription，STAT)及骨成型蛋白通路(bone morphogenetic protein, BMP)等都參與了神經系統的形成，且這些通路之間成網狀互相協同作用，精密地共調控了神經管的完美閉合。

1.2NTDNTD是由神經管閉合不全或早閉所導致的一種嚴重先天畸形，臨床表現為無腦兒、脊柱裂、露腦畸形、腦膨出、腦脊髓膜膨出等。研究表明NTD的發生是環境和遺傳因素共同作用的結果。其中，葉酸代謝途徑是研究最為廣泛的與NTD發病相關的功能機制，機體缺乏葉酸時可通過減少核酸合成(嘌呤和胸苷)，使同型半胱氨酸水平升高及改變體內甲基化水平來引起NTD[6]。此外，在神經管閉合過程中，神經褶形態穩定所需的細胞骨架蛋白、神經褶閉合所需的整合/黏附蛋白、神經細胞不斷增殖所需的細胞周期、細胞存活或凋亡相關蛋白、細胞外基質蛋白等這些蛋白因子的功能受到干擾時可能會誘發NTD[5]。而一些轉錄協同激活因子、染色質重塑復合物、轉錄調控分子、蛋白質功能調控因子、泛素化降解復合物等，以及前述PCP、Shh等一些重要信號通路的異常，亦都可能誘導NTD的發生。而作為轉錄后調控基因表達的重要方式之一，miRNAs在神經管形成的各個重要環節中發揮著關鍵作用，本綜述重點對這種調控機制及其對NTD形成的可能機制進行探討。

2 miRNAs與神經管發育

miRNAs在神經系統發育過程中具有表達的組織特異性或富集性及時空特異性，研究發現，在人和小鼠中，miR-9、-124a、-124b、-135、-153、-183及-219只在大腦組織有特異性的表達，而miR-9*、-125a、 -125b、-128、-132、-137及 -139則在大腦中富集性表達[7]。利用MiRXplore芯片篩選發現，在小鼠胚胎的神經管發育過程中約有72個miRNAs有表達，進一步對處于神經管閉合期GD-8.5、GD-9.0和GD-9.5的胚胎進行miRNAs表達分析發現，有16個miRNAs在三期都有表達，而miR-638只特異在GD-9.0表達，miR-335、-130a、-199a-3p、-18b、-18a及miR-106a特異在GD-9.5表達，GD-8.5則無特異性的miRNA表達[8]。這些miRNAs時空特異性表達的非一致性，可能與大腦等中樞神經系統不同腦區形成中的時空特性具有相對應的特異性調控功能。

在腦內特異性表達的miRNAs中，miR-124及miR-9是研究最為廣泛的。成熟的miR-124序列從蠕蟲到人類完全保守，在分化或成熟的神經元細胞中特異性高表達[9]，它在神經管發育時可能通過抑制神經祖細胞的某些基因表達來維持神經元的分化[10]。如多聚嘧啶核苷酸序列結合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTBP)1是負調控PTBP2的一種選擇性剪接抑制劑，在非神經元細胞或神經祖細胞中高表達。miR-124可調控PTBP1使其表達水平下降，從而使PTBP2的蛋白表達迅速積累并促使非神經細胞向神經細胞的轉化，有趣的是，PTBP2也能被miR-124抑制，但抑制效率小于其對PTBP1的抑制效率[11]，這或許能解釋為什么在神經細胞中PTBP2比PTBP1的表達要遲緩一些。miR-124對神經發育調控的另一個證據來源于對羧基端結構域磷酸酶(small C-terminal domain phosphatases 1,SCPl)的研究，已知SCP1是RE1-沉默轉錄抑制子(repressor element-1-silencing transcription factor, REST)復合物的組成之一，在非神經元細胞中阻遏神經元特異基因的轉錄，而miR-124可靶作用SCP1從而解除其對神經元轉錄程序的阻遏，但同時，miR-124又受到REST的抑制，形成一個雙重負反饋環路[12-13]。此外，miR-124還可作用于整合信號蛋白Itgβ1、Itgα7、Itgα3、Itgα11等，影響神經管閉合時神經上皮細胞的遷移和黏附[14-15]。Leucht等[16]發現，中后腦邊界處(midbrain-hindbrain boundary,MHB)可釋放成纖維生長因子(fibroblast growth factor，Fgf)來誘導位于其前部的神經管發育為前腦，后部的發育為后腦，且轉錄因子Her5和Her9是維持該區未分化狀態的關鍵分子，而這些分子皆可被 miR-9特異性調控，但miR-9卻組織特異性地在MHB以外周圍區域表達，使MHB區域內的靶基因免受miR-9的抑制性調控，從而幫助劃定了MHB的邊界。值得注意的是，miR-124和miR-9能共調控參與許多生物過程的發生，如當神經發育進行時，二者可靶向抑制染色質重塑復合物BAF(Brahma-related gene 1-associated factors)53a的表達，從而使BAF53b得以激活并誘導樹突的形成，但在非神經元細胞中，REST沉默了miR-124和miR-9的表達， BAF53a成功抑制BAF53b令細胞維持在神經祖細胞狀態[17]。不僅如此，miR-124和miR-9還可共靶作用于STAT3信號通路分子，通過影響肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)或c-Met，對胚胎干細胞向神經細胞的定向分化進行調控[18-19]。

miR-103與miR-107雖在多種組織和器官中都有表達，但在大腦中表達最高[20]。研究發現，miR-103與miR-107可作用于CDK5R1基因的3’-UTR，使其不能編碼出激活CDK5所需的活化劑p35，從而影響神經細胞的遷移[21]。鋅指同源蛋白家族(zinc finger protein homologous family,ZH)X1也是接受miR103/107調控的一個潛在靶基因，ZHX1在體外體內實驗中均可有效沉默DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)3B[22]，也就是說，miR103/107間接參與了DNA甲基化的表觀修飾，與其協同發揮對神經管發育的調節作用。

已知血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)通路調控高等脊椎動物胚胎的血管生成，而miR-126可負調控神經管發育中VEGFA mRNA的表達，從而對神經系統血管網絡的形成和模式化起間接的調控作用[23]。通過拮抗Notch信號通路來實現神經管細胞遷移和血管形成的表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)L7也是miR-126的潛在靶基因[24-25]，另外，胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)是類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)通路上重要的成分和SHH通路上一重要的效應分子[26]，可通過在神經營養蛋白通路中發揮其對早期胚胎形成和神經管發生中不可或缺的功能作用[27]，而miR-126對IRS-1和可誘導IGF-1受體表達的Hoxa9基因都有靶調控作用[28-30]，即miR-126可能協同調節著神經管發育過程中IGF、Shh和神經營養蛋白通路的相互作用。

其它miRNAs在神經發育中也起到重要的調控作用，如miR-199a-5p 及miR-199a-3p可靶作用于Brm基因(在發育中的神經管中檢測有表達)，從而間接影響Swi-Snf染色質重塑復合物對轉錄激活和抑制的調控作用[31]，有趣的是，該2個miRNAs的表達又受到涉及顱神經管閉合的Twist-1蛋白的調節[32]，即提出了miRNAs可靶作用調控一些蛋白，亦可被一些蛋白反饋調控的觀點，這種機制的復雜性和精密性無疑為神經系統的完整發育提供極大保證。

3 miRNAs表達異常在神經管畸形中的可能作用機制

miRNAs的異常表達可能會對神經管發育做出錯誤調控，誘使NTD或其它神經系統疾病的發生。Zhang等[33]對孕期14～22周(腦與脊髓發育形成期)的人類無腦兒胚胎進行研究發現，miR-126、miR-198及 miR-451表達量水平與正常胎兒組相比明顯上調，而miR-9、-212、-124、-138及miR-103/107則表現為下調，進一步生物信息學的功能分析，約有881個可能的靶基因受這些miRNAs的作用調控，其中79個可能涉及同一蛋白網絡的互相作用，據此推斷，miRNAs的失調可能是產生無腦兒的致病緣由之一，且是由多個miRNAs表達異常誘發的。有人對RA致畸小鼠的研究發現，GD-13.5、-15.5、-17.5及GD-19.5四期的脊柱裂小鼠胚胎中miRNAs的表達情況具有明顯不同，從GD-13.5 到GD-19.5，miR-9/9*、miR-124a和miR-125b的表達量與正常組相比均下降[34]，提示這種miRNAs的失調在脊髓的畸化過程中可能是致病因素之一。

miR-34高表達時，它會靶作用于德爾塔樣配體1(delta-like-ligand 1,DLL1)，從而使Notch蛋白的胞內區不能釋放使得Notch通路受阻，引起下游Hes-1、-3、-5蛋白對原神經基因(neurogenin，Ngn)的抑制作用減弱，Ngn蛋白表達量升高，從而影響中-后腦神經發生的形成及dl2中間神經元的建立。而Ngn蛋白這種表達水平的升高，也是過表達的miR-221、-222負調控DNMT1使體內甲基化水平下降的間接結果，即miR-34和miR-221、-222在調節Notch通路中Ngn蛋白的表達水平上表現出一種協同機制。同時，miR-34不僅可直接靶作用于亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)，還可通過靶作用于轉錄因子E2F3間接與miR-24協同沉默二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)，共同對體內一碳代謝(one-carbon metabolism，OCM)和DNA甲基化水平做出負調控，正是miR-34異常高表達時對Notch及DNA甲基化兩通路的破壞，才可能誘使細胞過度增殖或分化過早熟導致NTD的發生[35]。

miR-19a及miR-19b可特異靶作用于低密度脂蛋白受體相關蛋白2(low-density lipoprotein receptor-related protein 2,LRP2)，已知該蛋白在孕中期小鼠胚胎中的神經上皮組織里高表達，可參與Wnt信號的轉導，若定向缺失LRP2基因，則會誘發胚胎死亡[36]。除此之外，miR-19還可靶作用于RhoB(調節背部神經管向神經嵴的層離)[37]、qkl(一旦缺失會導致神經管暴露)[38]、Id2(在顱神經褶中過量表達或在神經嵴遷移會導致神經管發育的早熟)等等[39]，若其失調錯表達，可能會誘使NTD的發生。

表1是對哺乳動物如小鼠和人類的神經組織中，檢測有表達的一些miRNAs及其對神經管發育影響的概括性總結。

表1 哺乳動物神經組織中檢測有表達的miRNAs及其對神經管發育的影響

由該表可以看出，miRNAs在神經系統發育過程中的作用以及表達變異對NTD發病機制的貢獻，主要是通過調控Wnt、Notch、細胞凋亡等通路的靶基因來實現的。

4 結論

本文重點闡述了miRNAs在神經管發育期間的作用，總體而言，神經管的正常發育是與其相關基因精確的時空特異性表達，信號轉導通路及基因表達調控網絡三方面的完美合作是密不可分的，其中任意一方發生變異，都可能誘使NTD的發生。而miRNAs正是在基因的轉錄后調控中起著不可替代的作用，一些miRNAs階段特異性的表達失調或對靶基因mRNAs的不準確沉默，都有可能是引起NTD的誘因，但對這方面的研究尚不明確，相信隨著科學技術的發展，miRNA作為分子診斷的標志物在NTD中的應用指日可待。

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TemporalandspatioaleffectsofenrichedmiRNAsinbrainandpossibleroleinneuraltubedefects

MicroRNAs (miRNAs) are known to play an important role in regulating the cell proliferation, differentiation and organogenesis. Abnormal expression of miRNAs is associated with increased risk for various diseases, such as neural tube defects (NTD), which is a severe developmental disease as the result of closing the neural tube incompletely or too early. The present review summarizes some enriched miRNAs in the brain of mammals and their spatial temporal feature, and tries to elaborate the relationship between the aberrant expression of miRNAs and the pathogenesis of NTD.

微小RNA; 神經管缺陷; 哺乳動物

MicroRNA; Neural tube defects; Mammals

BAI Bao-ling, LI Hui-li, CHEN Shu-yuan, WANG Xiao-lei, ZHANG Qin, ZHAO Hui-zhi, ZHANG Ting

(CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China.E-mail:zhangtingcv@yahoo.com.cn)

R394.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.12.034