基于UPLC/Q-TOF-MS不同比例人參配伍藜蘆增毒的物質基礎及動物毒性關聯性研究

楊 亮, 王宇光, 梁乾德, 劉浩生, 馬增春, 肖成榮,譚洪玲, 湯響林, 張伯禮, 高 月

(1.安徽醫科大學研究生學院，安徽 合肥 230032； 2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理研究室，北京 100850；3.天津中醫藥大學，天津 300193)

2012-04-26；

2012-07-10

國家重點基礎研究發展計劃(批準號：2011CB505304,2012CB518402), 國家自然科學基金(批準號：81073149)， 北京市自然科學基金(批準號：7112110)資助

楊 亮(1989～)，男，碩士研究生，中藥藥理學專業。E-mail: yangliang19890322@163.com

王宇光,男，從事中藥藥理學研究。E-mail:wang-yuguang@139.com

高 月，女，博士，研究員，從事中藥藥理毒理研究。E-mail: gaoyue@nic.bmi.ac.cn

基于UPLC/Q-TOF-MS不同比例人參配伍藜蘆增毒的物質基礎及動物毒性關聯性研究

楊 亮1,2, 王宇光2, 梁乾德2, 劉浩生1, 馬增春2, 肖成榮2,譚洪玲2, 湯響林2, 張伯禮3, 高 月2

(1.安徽醫科大學研究生學院，安徽 合肥 230032； 2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理研究室，北京 100850；3.天津中醫藥大學，天津 300193)

通過小鼠的急性毒性實驗，探索中藥十八反中藜蘆與人參藥對不同配比時毒性變化趨勢，結合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術(UPLC/Q-TOF-MS)對不同配比對應的毒性成分進行分析，采用MassLynx4.1分析軟件，結合主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法判別(OPLS-DA)分析生物堿類成分變化。固定藜蘆用量時，藜蘆與人參在不同配比情況下小鼠死亡率隨人參劑量增大呈下降趨勢，藜蘆酰棋盤花胺、3-當歸酰棋盤花胺、紅介芬胺、計米亭堿、藜蘆胺和3-藜蘆酰基計明堿等生物堿含量在不同配比中的變化趨勢與動物毒性變化一致。以上幾種生物堿在藜蘆與人參合用時可能是毒性效應的關鍵成分，能夠反映配伍毒性的變化趨勢。

藜蘆；人參；急性毒性；UPLC/Q-TOF MS

中藥成分復雜，自古人們對其探索的最大難點就是其化學本質，中藥復方更是如此，但中藥在臨床上應用十分廣泛。中藥十八反是中藥理論中重要組成部分，其配伍禁忌一方面限制了中藥在臨床上的應用，同時也給中藥蒙上了一層神秘的面紗[1-2]。藜蘆與人參就是中藥十八反中非常重要的一對相反藥對。藜蘆有大毒，在中藥復方中主要用于催吐，在臨床使用時相當謹慎；人參是常見的補氣藥，也是名貴藥材，享有“東北三寶”的美譽，但是受傳統中藥“十八反”理論的影響，限制了其臨床使用[3-6]，因此探究其相反作用的物質基礎，并在化學層面上弄清二者不同配比對其毒性成分溶出和毒性影響的規律，對理解相關中藥配伍禁忌和臨床應用都有重要意義。目前研究藜蘆化學成分的文獻并不少見[7-10]，藜蘆中主要的毒性來源為其生物堿類，因此對生物堿類成分變化研究顯得尤為關鍵。

本實驗是在前期兩味單藥急性毒性實驗結果的基礎上進行的，即藜蘆半數致死量(LD50)為2.566 g/kg,人參最大耐受量(MTD)為80 g/kg。首先固定藜蘆用量，將藜蘆與人參不同配比的水煎液進行小鼠的急性毒性實驗，并對上述水煎液對應進行物質基礎分析，即在兩個層面上設計本實驗:一方面考察藜蘆與人參在不同配比時的動物毒性變化趨勢，另一方面利用超高效液相色譜-飛行時間電噴霧質譜技術(UPLC/Q-TOF MS)分析毒性成分的變化規律，再結合主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)[11-13]，在化學層面上分析藜蘆與人參在不同配比情況下毒性成分的變化規律，將毒性效應與毒性成分變化進行對應性研究[14-15]，希望從中發現藜蘆與人參配伍相反的規律及發揮毒性的物質，以期為臨床合理應用相關藥物提供參考。

1 試驗部分

1.1試劑和儀器

1.1.1實驗材料 KM小鼠雌雄各110只，18～22 g，6～8周齡，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供[合格證號：SCXK-(軍)2007-004]。

藜蘆：購自安徽豐原銅陵中藥飲片公司，產自長春華家；人參：購自吉林銀河參業科技開發有限公司，產自吉林撫松。均經軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所馬百平教授鑒定，分別為百合科藜蘆屬植物藜蘆VeratrumnigrumLinn.的干燥根和五加科人參屬植物人參PanaxginsengC.A. Mey.的干燥根。

1.1.2實驗儀器 Acquity UPLC-Synapt MS色譜-質譜聯用儀：美國Waters公司產品；Mass Lynx V14.1質譜工作站：美國Waters公司產品；Millipore Simplicity純水儀；Herarus Labofuge 400R冷凍離心機；電子天平(BS 223S型)：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產品；旋轉蒸發器(RE52CS型)：上海亞榮生化儀器廠產品；電子調溫電熱套(98-1-B型)：天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠產品；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司產品。

1.1.3實驗試劑 乙腈(色譜純)：購自Fisher Scientific公司；超純水經Millipore純水系統純化；甲酸(HPLC級)[16]。

1.2實驗過程

1.2.1供試樣品的制備 藜蘆、人參按一定量精確稱重混合，加入700 mL蒸餾水，浸泡1 h后煎煮，微沸1 h提取濾液，3層紗布過濾。稱量濾液，第二煎加入與第一煎得到的濾液等量的蒸餾水，煎煮1 h后用3層紗布過濾提取煎液，合并兩次濾液，即為藜蘆人參的合煎液；將上述水煎液置于無菌容器中待動物急性毒性實驗用。

將上述制備的煎液靜置，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，于4 ℃保存，待成分分析檢測。各組的實驗用量分布列于表1。

1.2.2急性毒性實驗 KM小鼠適應2～3天后，隨機分成A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K共11組，分別對應藜蘆、人參的配比藥對10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，給藥前12 h禁食不禁水，精確稱重后，按照0.4 mL/10 g口服給藥，觀察兩周，并記錄小鼠臨床表現和死亡情況。

表1 各組動物實驗所用的藜蘆、人參的不同配比

1.2.3物質成分分析實驗 采用Waters Acquity BEH C18(100 m×2.1 mm×1.7 μm)色譜柱；柱溫45 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；正離子模式，梯度洗脫(0～1.0 min：2%B；1.0～2.0 min：2%～5%B；2.0～5.0 min：5%～20%B；5.0～7.0 min：20%～30%B；7.0～10.0 min：30%～33%B；10.0～13.0 min：33%～36%B；13.0～17.0 min：36%～40%B；17.0～18.0 min：40%～100%B；18.0～19.0 min：100%～2%B；20.0 min：2%B)。

采用電噴霧電離離子源(ESI)，正離子模式檢測；質量掃描范圍：m/z100～1 200；毛細管電壓3 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；霧化溫度450 ℃；殼氣流速900 L/h；以亮氨酸-腦啡肽進行精確質量校正([M+H]+556.277 1)。

液質聯用數據采用Waters公司提供的Marker Lynx 4.1軟件進行峰提取、峰對齊及歸一化等處理，利用PCA和OPLS-DA找出各組之間化合物指紋圖譜的差異，結合標準品和質譜數據庫檢索，對潛在的化學標記物進行快速鑒定。

2 結果與討論

2.1實驗結果

2.1.1急性毒性實驗 固定藜蘆用量為2.566 g/kg，按藜蘆、人參10∶1～1∶10水煎液進行小鼠急性毒性實驗，結果列于表2。

表2 藜蘆、人參不同配比動物實驗結果

2.1.2物質成分分析實驗 將上述10∶1～1∶10水煎液進行動物毒性實驗同時，對應地進行各組水煎液的物質成分分析，經過MassLynx4.1分析軟件，結合主成分分析及正交偏最小二乘法判別對差異成分進行了鑒定，將差異成分在總離子流圖中做出標記，示于圖1。為了更清晰的表明毒性成分與毒性趨勢的相關性，將兩種藥物A～K組合煎液在正離子模式下檢測得到的差異成分化合物示于圖2，用正交偏最小二乘法得到的差異成分鑒別結果示于圖3。其中化合物5和6尚不能準確區分，化合物7未能鑒定。動物死亡趨勢圖示于圖4。主要的差異物質離子流提取及質譜圖示于圖5。

實驗分析中涉及到的化合物經過MHDB數據庫的檢索以及參考相關文獻得到[17-19]。將各組總分析成分列于表3，A組與K組分析成分單獨列于表4。

注：A.10∶1; B.8∶1; C.6∶1, D.4∶1; E.2∶1; F.1∶1; G.1∶2; H.1∶4; I.1∶6; J.1∶8; K.1∶10圖1 藜蘆人參不同配比正離子模式總離子流圖Fig.1 The total ion chromatogram of veratrum nigrum and ginseng with different ratio

圖2 藜蘆人參合煎液A～K組正離子模式下差異成分化合物Fig.2 Selected ion intensity trend plots analyzed using Marker lynx 4.1 software

圖3 人參藜蘆合煎液A～K組正離子 圖4 藜蘆人參不同配比動物死亡趨勢圖模式下正交偏最小二乘法差異成分鑒別 Fig.4 The chart of death tendency from A to K Fig.3 OPLS-DA/Scores plot from A to K of ginseng and veratrum nigrum obtained using Pareto scaling with mean centering

圖5 藜蘆人參不同配比的主要差異物質正離子模式離子流圖Fig.5 The ion chromatogram of main toxicity component from veratrum nigrum and ginseng with different ratio

峰號保留時間/min化合物名稱分子式[M+H]+/(m/z)測得分子質量/u理論分子質量/u質量偏差/10-614．72VerdineC27H41O5N460．3056460．30631．5226．02VeratrosineC33H49O7N572．3593572．35871．04836．49VeratrumalkamineC36H51O10N658．3597658．35910．91146．65RubjervineC27H43O2N414．3359414．3372-3．156．80GermidineC34H53O10N636．3753636．37480．78667．16GermidineC34H53O10N636．3746636．3748-0．31477．42Unknown-472．3421--87．46VeratramineC27H39O2N410．3048410．30592．6897．633?VeratroylgermineC36H53O11N676．3691676．3697-0．887108．273?AngeloylzygadenineC32H49O8N576．3531576．3536-0．868

表4 A組與K組人參藜蘆合煎液的正離子模式下的分子離子峰鑒別

2.1.3A組與K組分析結果 為了進一步挖掘毒性成分的變化，選取藜蘆與人參配伍比例差異最大的兩組，也是毒性效應差別最為明顯的A組和K組進行分析，試圖進一步探究毒性成分與毒性趨勢的相關性。其中物質成分差異圖示于圖6～8，各配伍組對應的動物毒性趨勢圖示于圖9。

2.2討論

人參與藜蘆作為中藥十八反中的重要藥對，要想真正弄清其在體內代謝及發揮藥效的有效成分，必須研究其物質成分與毒性的關聯性。

在小鼠的急性毒性實驗中，固定藜蘆用量，當人參劑量較低時，小鼠死亡率較高，隨著人參劑量增大，小鼠死亡率呈下降趨勢。說明人參與藜蘆配伍時人參比例較小時毒性增大，隨著人參比例增加毒性下降。提示配伍禁忌不是絕對的，與二者用量有密切關系，人參用量大時，可能還會有減毒作用產生。

在物質成分分析實驗中[20]，分析了從A組(藜蘆：人參=10∶1)到K組(藜蘆：人參=1∶10)的物質成分變化，其中藜蘆酰棋盤花胺、3-當歸酰棋盤花胺、紅介芬胺、計米亭堿、藜蘆堿和3-藜蘆酰基計明堿等隨著人參比例增大含量下降，與動物實驗結果相吻合，也說明這些成分在藥物發揮毒性效應中起到重要作用。然后選取了配伍比例相差最大的A組和K組進行分析，這兩組也是毒性效應差別最大的兩組。結果顯示，A組中藜蘆新堿、計米亭堿、藜蘆胺和3-當歸酰棋盤花胺的含量明顯高于K組。

圖6 藜蘆人參合煎液A組與K組正離子模式下正交偏最小二乘法差異成分鑒別Fig.6 OPLS-DA/Scores plot between A and K of ginseng and veratrum nigrum obtained using Pareto scaling with mean centering

圖7 藜蘆人參合煎液A組與K組正離子模式下正交偏最小二乘法差異成分的S曲線Fig.7 OPLS-DA/S-Plot between A and K ginseng and veratrum nigrum obtained using Pareto scaling with mean centering

圖8 藜蘆人參合煎液A組與K組正離子模式下差異成分化合物Fig.8 Selected ion intensity trend plots analyzed using Marker lynx 4.1 software

圖9 藜蘆人參合煎液A組與K組動物死亡趨勢 Fig.9 The chart of death tendency between A and K

綜合考慮兩部分實驗結果：藜蘆中含有的毒性生物堿很多，與人參配伍后，部分生物堿的含量在人參加入量較小時增大明顯，隨著人參加入量增大含量下降。反應在動物急性毒性實驗上，即人參量小死亡率高，人參量大死亡率下降。因此在臨床上，中藥的劑量與毒性之間存在一定的關聯性，同時毒性成分的變化可能是影響到動物死亡率變化的重要因素，這為進一步進行體內檢測提供了線索。

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UPLC/Q-TOF-MSBasedtheDiversityofToxiferousCompositionoftheToxicityofAnimalsandinDifferentCombinationofVeratrumNigrumandGinseng

YANG Liang1,2, WANG Yu-guang2, LIANG Qian-de2, LIU Hao-sheng1, MA Zeng-chun2, XIAO Cheng-rong2, TAN Hong-ling2, TANG Xiang-lin2, ZHANG Bo-li3, GAO Yue2

(1.GraduateSchoolofAnHuiMedicalUniversity,Hefei230032，China; 2.InstituteofRadiationandIrradiationMedical,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China; 3.TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)

In order to study toxicity changes in different matching between the herbal ginseng and veratrum nigrum of eighteen incompatible medication in traditional medicine, the acute toxicity of mice treated with veratrum nigrum-ginseng combination of the eighteen incompatibal (Shi Ba Fan) was explored. UPLC/TOF-MS with Principal Components Analysis (PCA) were used to analyze the same samples used in acute toxic experiment. The results showed that death rate of mice was decreased in the rise of compatibility of ginseng with fixed dose of veratrum nigrum, toxicity alkaloid series such as veratrosine, veratrum alkamine, 3-angeloylzygadenine, germidine, veretramine, rubijervine were also increased. Therefore, above alkaloid series may be key factors contributed to the poisoning effect of ginseng combined with veratrum nigrum.

veratrum nigrum; ginseng; acute toxicity; UPLC/Q-TOF-MS

O 657.63

A

1004-2997(2012)05-0257-08