重癥急性胰腺炎患者治療前后血清蛋白組學(xué)的變化

任俊 余開煥 馬鵬 余佳 陳辰 張愛民

·論著·

重癥急性胰腺炎患者治療前后血清蛋白組學(xué)的變化

任俊 余開煥 馬鵬 余佳 陳辰 張愛民

目的比較重癥急性胰腺炎(SAP)患者治療前后血清蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，尋找能夠判斷SAP病情好轉(zhuǎn)的血清蛋白質(zhì)。方法利用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)分析20例SAP患者治療前及治療后7 d的血清蛋白質(zhì)譜，并進(jìn)行APACHEⅡ評分。結(jié)果SAP患者治療后7 d的APACHEⅡ評分為(10.70±3.47)分，顯著低于入院時(shí)的(13.00±2.21)分(t=4.272,P=0.002)。治療前后一共檢測到血清中132個(gè)蛋白質(zhì)峰，其中質(zhì)荷比2000至40 000間有27個(gè)差異蛋白質(zhì)峰(P<0.05)。分子質(zhì)量47 000的蛋白在SAP病情緩解后表達(dá)下調(diào)，分子質(zhì)量115 000及159 000的蛋白在SAP治療后明顯上調(diào)。結(jié)論用SELDI-TOF-MS技術(shù)能檢出SAP患者治療前后血清蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，分子質(zhì)量115 000和159 000蛋白的上調(diào)及47 000蛋白的下調(diào)可能是SAP病情好轉(zhuǎn)的征兆。

胰腺炎，急性壞死性； 蛋白質(zhì)組； 血清； 預(yù)測和判斷

目前臨床上有多種預(yù)測急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)嚴(yán)重程度的方法[1-2],其中以APACHE Ⅱ評分最為常用，也得到了廣泛的認(rèn)可，但其評分項(xiàng)目繁多，計(jì)算方法復(fù)雜，臨床使用價(jià)值有限[3]。因此需要尋找能夠判斷AP嚴(yán)重程度和預(yù)后的簡單而實(shí)用的特異性標(biāo)志物。本研究檢測重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)患者在治療前后血清蛋白質(zhì)譜表達(dá)的差異，以篩選反映SAP治療效果和預(yù)后的蛋白質(zhì)。

材料和方法

一、臨床資料

選取2010年7月至12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科收治的臨床資料完整的20例SAP患者為研究對象，其中男性11例，女性9例，平均年齡(45±18)歲。發(fā)病至入院平均時(shí)間為(7±4)h，且未做任何治療。所有患者診斷均符合2007年《重癥急性胰腺炎診治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[4]。入院后均行常規(guī)個(gè)體化綜合非手術(shù)治療。入院第1天及治療后7 d進(jìn)行APACHEⅡ評分。

二、血清蛋白組學(xué)檢測

治療前及治療后7 d各抽取外周靜脈血2 ml，3000 r/min離心10 min，取血清，置-80℃保存。

檢測前4℃下融解血清，每10 μl血清中加入20 μl U9裂解液(9 mol/L urea，2% CHAPS，50 mmol/L Tris-HCL，1% DDT,pH9.0)孵育30 min，加入370 μl WCX緩沖液(50 mmol/L NaAc，pH4.5)稀釋。每個(gè)PCR管中加入50 g/L WCX磁珠100 μl，置磁性分離板上分離2 min，棄去上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl活化2次。活化的納米磁珠中加入100 μl處理好的血清樣品，震蕩孵育1 h，置磁性分離板上分離2 min，棄上清液，加入100 mmol/L NaAc 100 μl洗滌2次，用10 μl 1% TFA洗脫結(jié)合在磁珠上的蛋白，取5 μl蛋白洗脫液加5 μl SPA飽和液(50% ACN+0.5% TFA)充分混合，取2 μl混合液點(diǎn)樣于僅起載體作用的金芯片上(Au-chip.Biorad),自然風(fēng)干，采用SELDI-TOF-MS(BIORAD)采集蛋白表達(dá)譜。

儀器主要參數(shù)：激光強(qiáng)度175，檢測靈敏度6，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍1000～20 000，最高分子質(zhì)量為50 000。收集樣品點(diǎn)數(shù)100次。數(shù)據(jù)收集分子質(zhì)量范圍1000～50 000。先用信噪比(s/n)>5和>2各過濾一次。篩出的質(zhì)荷比峰在10%以上的樣本中同時(shí)存在，且同一質(zhì)荷比峰在不同樣本中的偏差<0.3%(以去除原始數(shù)據(jù)中的噪聲)。經(jīng)上述處理后，用Ciphergen proteinchip3.1軟件自動采集數(shù)據(jù)，根據(jù)所獲得的原始數(shù)據(jù)快速精確地繪制出蛋白質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為波峰強(qiáng)度，即蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(M/Z)，即蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、APACHEⅡ評分的變化

SAP患者入院第1天的APACHEⅡ評分為(13.00±2.21)分，治療后7 d的APACHEⅡ評分為(10.70±3.47)分，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.272，P=0.002)，表明SAP病情緩解。

二、差異表達(dá)蛋白的篩選

SAP患者治療前后血清中一共檢測到132個(gè)蛋白質(zhì)峰，質(zhì)荷比在2000～40 000間有27個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)(P<0.05)，其中分子質(zhì)量47 000的蛋白在SAP病情緩解后表達(dá)下調(diào)，分子質(zhì)量115 000及159 000的蛋白在SAP治療后明顯上調(diào)(圖1)。

圖1治療前(1)后(2)分子質(zhì)量47 000(a)、115 000(b)、159 000(c)蛋白的質(zhì)譜圖

討 論

SAP患者約占AP的15%～20%，常出現(xiàn)危及生命的全身并發(fā)癥或局部并發(fā)癥，病死率可達(dá)15%～56%[5]。AP時(shí)胰腺最早的改變是局部的炎癥伴隨著消化酶顆粒的激活，繼而表現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致多器官損傷。胰腺內(nèi)外及細(xì)胞內(nèi)外的各種因素均參與AP的病理生理改變，在局部和全身的炎癥反應(yīng)中起著重要作用[6]。Fétaud1等[7]證實(shí)，AP時(shí)的炎癥可增加血管通透性，使胰腺局部蛋白及炎癥介質(zhì)進(jìn)入血液，導(dǎo)致AP血清蛋白質(zhì)也發(fā)生相應(yīng)的改變。我們前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測SAP和輕癥急性胰腺炎(MAP)大鼠血清蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在9500和9700的蛋白表達(dá)下降是MAP向SAP轉(zhuǎn)化的征兆[8]。Papachristou等[9]也發(fā)現(xiàn)SAP患者血清分子質(zhì)量43 000和117 000的兩個(gè)蛋白明顯不同于MAP患者，其中分子質(zhì)量117 000蛋白區(qū)分MAP和SAP的敏感性接近100%，特異性達(dá)81%。本研究應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測SAP患者治療前后的血清蛋白質(zhì)譜的變化，發(fā)現(xiàn)27個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中分子質(zhì)量47 000、115 000及159 000蛋白的差異最為明顯，47 000蛋白在SAP病情緩解時(shí)表達(dá)減少，而115 000及159 000蛋白則表達(dá)增加。提示分子質(zhì)量47 000蛋白表達(dá)下調(diào)、115 000和159 000蛋白表達(dá)上調(diào)可能是SAP患者治療后病情緩解的預(yù)兆，為臨床評估SAP的嚴(yán)重程度及治療效果提供新的指標(biāo)。

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Serumproteomicanalysisofpatientwithsevereacutepancreatitisbeforeandaftertreatment

RENJun,YUKai-huan,MAPeng,YUJia,CHENChen,ZHANGAi-min.

DepartmentofHepatobiliary&LaparoscopicSurgery,People′sHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

YUKai-huan,Email:yukaihuan@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the different expression of the serum proteome of patient with severe acute pancreatitis (SAP) before and after treatment, and search for the protein that can predict SAP improvement.MethodsSELDI-TOF-MS was used to analyze the expression of serum protein spectrum of 20 SAP patients before treatment and 7 days after treatment, and make the APACHEⅡ score at the same time.ResultsThe APACHEⅡ score was 10.70±3.47 in patients with SAP 7 days after treatment, which were significantly lower than that before treatment (13.00±2.21,P<0.05). One hundred thirty-two spectral peak clusters were detected before and after treatment, there were 27 proteins that had significantly different signal intensities had been detected from 2000 Da to 50000 Da (P<0.05). The peak cluster at 47 000 Da was significantly down-regulated after SAP attenuation. While the peak clusters at 11 700 Da and 15 900 Da were significantly up-regulated after treatment.ConclusionsSerum analysis with SELDI-TOF MS can detect the different expression of the SAP serum proteomics before and after treatment, the increased expression of the protein with molecular weight of 11 500 Da and 15 900 Da and the decreased expression of 4700 Da may be a signal of improvement of SAP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Proteome; Serum; Forecasting

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.001

湖北省自然科學(xué)基金(131349)

430060 武漢，武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽腔鏡外科

余開煥，Email:yukaihuan@medmail.com.cn

2011-11-22)

(本文編輯：呂芳萍)