胰腺癌MUC1 mRNA轉染樹突細胞疫苗誘導特異性抗腫瘤的免疫反應

陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 劉旭 趙佳鈞 王迪

·論著·

胰腺癌MUC1 mRNA轉染樹突細胞疫苗誘導特異性抗腫瘤的免疫反應

陳江 郭曉鐘 李宏宇 邵曉東 劉旭 趙佳鈞 王迪

目的研究人胰腺癌MUC1 mRNA轉染樹突細胞(DC)誘導的特異性抗腫瘤免疫反應，為DC疫苗治療胰腺癌提供實驗依據。方法從外周血中分離單核細胞(PBMC)并培養成DC，從細胞形態和表面標志進行鑒定。通過RT-PCR擴增胰腺癌MiaPaCa-2細胞的MUC1 mRNA后用電穿孔法將其轉染DC。采用實時定量PCR和蛋白質印跡法檢測培養不同時間點DC的MUC1的表達。用四甲基偶氮唑藍法檢測DC存活率。采用51Cr標準細胞毒實驗觀察轉染MUC1 mRNA的DC誘導的特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應；應用ELASA法檢測CTL的IFN-γ釋放量。結果培養獲得的細胞呈現典型的DC形態特征和表面標志(CD40+、HLA-DR+、CD83+、CD86+)。MUC1 mRNA轉染 DC 48 h后，細胞MUC1 mRNA表達水平最高，為38.43(36.89～48.06)，蛋白表達亦最強。轉染后DC的存活率穩定在80%左右。轉染MUC1 mRNA的 DC可有效誘導HLA-A2+/MUC+特異性CTL免疫反應；胰腺癌Capan-2細胞與轉染MUC1的DC刺激MUC1特異性CTL的24 h IFN-γ釋放量分別為(28.44±4.96)和(16.31±2.54)U/ml，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論人胰腺癌MUC1 mRNA體外轉染DC后可誘導CTL產生特異性抗腫瘤免疫反應。

樹突細胞； RNA，信使； 轉染； 胰腺腫瘤； T淋巴細胞，細胞毒性

樹突細胞(dendritic cells, DCs)腫瘤疫苗作為一種主動免疫的抗腫瘤方法，其臨床應用已引起了學界的高度重視[1]。MUC1是一種高糖基化蛋白，具有高度的抗原性，并能夠被細胞毒T細胞(CTL)所識別，因此被認為是腫瘤生物治療的理想的靶點[2]。超過90%的胰腺癌存在MUC1的高表達，故本研究將人胰腺癌MiaPaCa-2細胞MUC1 mRNA轉染患者DC，觀察轉染后DC誘導的MUC1特異性CTL對靶細胞的殺傷作用，為臨床構建胰腺癌相關抗原MUC1 DC腫瘤疫苗提供實驗依據。

材料和方法

一、DC的分離、培養和鑒定

收集20例健康志愿者和8例胰腺癌患者(沈陽軍區總醫院供血科、消化科提供)外周血，采用Ficoll-plus paque T密度梯度離心法分離單核細胞(PBMC)，常規培養。取未貼壁細胞另作培養備用；貼壁細胞繼續培養20 h，加入800 IU/ml重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子和500 IU/ml重組人IL-4(美國PeproTec公司)培養5 d，加入10 ng/ml TNF-α繼續培養2 d，收集成熟DC。分別使用倒置顯微鏡和電子顯微鏡觀察DC形態學特征。收集的DC分裝5管，分別加入鼠抗人熒光標記的CD40、HLA-DR、CD83、CD86單抗和作為對照的IgG(美國Santa-Cruz公司)，用流式細胞儀分析鑒定。每個樣品分析細胞數>1×106個。

二、胰腺癌細胞MUC1 mRNA擴增及DC轉染

人胰腺癌細胞株MiaPaCa-2為沈陽軍區總醫院消化科實驗室保存。常規培養、傳代。取對數生長期細胞，用Trizol抽提細胞總RNA。采用Primer premier 5.0軟件設計MUC1及作為校正的看家基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)引物。MUC1引物上游5′-TGA GTG ATG TGC-3′，下游5′-CTG CCC GTA GTT CTT TCG-3′，產物158 bp；HPRT引物上游5′-GGT TCT CGG GGC ACC TCT-3′，下游5′-TCG GCT TGA AAT GAC CTA ATG-3′，產物221 bp。應用Sensiscript RT Kit (Qiagen公司)逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，應用T7 mMessage mMachine試劑盒(Ambion公司)于37℃ 2～4 h體外轉錄為MUC1 mRNA，沉淀后保存。參考Milazzo等[3]方法，2 mm的電極杯內加入200 μl DC懸液和20 μg MUC1 mRNA進行電轉染。電壓300 V、間隔125 ms、4個脈沖，持續250 ms。電穿孔后立刻置入4℃冰箱靜置10 min，移入加有完全培養基的12孔培養板中培養0、12、24、48、72、96 h。

三、DC的MUC1表達及存活率檢測

收集1×106個電轉染的DC，用Trizol提取總RNA，應用QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen公司)行PCR。反應條件：95℃ 15 min，94℃ 20 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，40個循環，最后68℃ 60 s中止反應。用雙標準曲線法，以轉染后0 h的表達量為1進行相對定量[4]。每個樣品重復2次，取均值。

將電轉染的DC懸于提取緩沖液 (100 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%去氧膽酸鈉，5 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物，0.1 mmol/L胃酶抑素A，0.1 mmol/L抗痛素，0.1 mmol/L糜蛋白酶抑制素，0.2 mmol/L亮肽素，10 μg/ml抑酞酶，0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑，1 mM 苯甲脒) 冰上反應15 min，14 000 r/min離心20 min，取上清，應用BCA法定量蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測MUC1蛋白表達。兔抗人MUC1多抗購自DPC-Biermann公司，ECL購自Amersham公司。同時應用四甲基偶氮唑藍(Sigma公司)法檢測DC存活率。

四、51Cr標準細胞毒實驗

按Heiser等[5]方法，從非貼壁的PBMC中獲得MUC1特異性CTL作為效應細胞。分別以轉染MUC1 mRNA、PBMC總RNA、綠色熒光蛋白(GFP)RNA、MiaPaCa-2總RNA 24 h的DC以及Capan-2和MiaPaCa-2細胞作為靶細胞。將2×106個靶細胞與100 μ Ci NaCrO4(中國同位素公司)培養1 h，計數5×103個51Cr標記的靶細胞與連續稀釋的效應細胞以不同的效靶細胞比在96孔板中培養6 h。吸取50 μl上清液，使用伽馬射線測量計數器測量51Cr的每分鐘脈沖數(CPM)。計算特異性裂解液的裂解百分比，即[(實驗CPM-自發CPM)/(最高CPM-自發CPM)]×100%。實驗重復3次，取均值。

五、γ-干擾素(IFN-γ)釋放實驗

將上述靶細胞作為刺激細胞，以自體MUC1特異性CTL細胞作為反應細胞。按照CTL細胞與刺激細胞的設定比例，在96孔板中常規培養24 h，總體積200 μl。取培養上清，采用ELASA試劑盒(Genzyme公司)檢測IFN-γ分泌量，實驗重復3次。結果以105反應細胞24 h的IFN-γ釋放量表示(U/ml)。

六、統計學處理

結 果

一、DC的形態及表型

PBMC經體外分離、培養，數量達初始數量的10倍左右。多數細胞組合成黏附力松散的細胞克隆，呈懸浮或團塊生長，胞體向四周伸出大量樹枝狀或裙褶狀不規則突起，呈現DCs特殊的形態特征(圖1)。細胞具有典型的成熟DC表面標志：CD40+、HLA-DR+、 CD83+和CD86+(圖2)。

圖1DC的光鏡(a)、掃描(b)及透射(c)電鏡下的形態(×200，刻度線為1 μm)

圖2 DC的表面標志

二、MUC1 mRNA轉染后DC的MUC1表達

MUC1 mRNA電轉染DC 0、12、24、48、72、96 h的MUC1mRNA表達量分別為1、14.87(12.49～17.35)、24.11(21.82～27.30)、38.43(36.89～48.06)、17.39(13.02～19.13)、5.92(3.91～7.87)，以轉染后48 h的表達水平最強(圖3)。MUC1蛋白表達亦在48 h最強，而后漸減弱(圖4)。

圖3 轉染后DC的MUC1 mRNA表達

圖4 轉染后DC的MUC1蛋白表達

三、MUC1 mRNA轉染后DC的存活率

MUC1 mRNA轉染后DC的存活率在不同時間點相差不大，穩定在80%左右(圖5)。

圖5 MUC1 mRNA 轉染后DC的存活率

四、自體MUC1特異性CTL對DC及胰腺癌MiaPaCa-2、Capan-2細胞的殺傷力

無論是健康志愿者還是胰腺癌患者，轉染MUC1 mRNA的DC均能誘導自體MUC1特異性CTL的免疫反應，能有效識別和殺傷轉染MUC1 mRNA的DC，而轉染GFP mRNA、PBMC總RNA的DC無識別和殺傷作用，并且轉染MUC1 mRNA的DC誘導的CTL在識別和殺傷特異性靶細胞的能力和強度上優于轉染MiaPaCa-2總RNA的DC(圖6)。

圖6 MUC1特異性CTL對DC的殺傷力

但來自人類HLA-A2+胰腺癌患者的MUC1特異性CTL能有效識別和殺傷HLA-A2+/MUC1+的Capan-2胰腺癌細胞，而不能識別和殺傷HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2胰腺癌細胞，亦不能識別和殺傷HLA-A2+/MUC1-的靶細胞(轉染PBMC或GFP RNA的DC，圖7)。

圖7MUC1特異性CTL對不同HLA-A2和MUC1表達靶細胞的殺傷力

五、DC刺激抗原特異性CTL的IFN-γ釋放

轉染PBMC或GFP RNA的DC及HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2不能刺激抗原特異性CTL分泌IFN-γ；而HLA-A2+/MUC1+的Capan-2細胞及轉染MUC1 mRNA的DC能顯著激活、誘導MUC1特異性CTL分泌IFN-γ。Capan-2刺激CTL的24 h IFN-γ釋放量達(28.44±4.96) U/ml，遠高于轉染MUC1的DC的(16.31±2.54)U/ml(P<0.05，圖8)。

圖8 不同效應細胞刺激MUC1特異性CTL的IFN-γ釋放

討 論

DC腫瘤疫苗的實質是以CTL為基礎的細胞免疫，疫苗構建的關鍵因素在于選取適合的腫瘤相關抗原(TAA)。盡管已證實惡性細胞高表達TAA，但其中少有易受T細胞影響的靶點[6]。MUC1是高糖基化I型糖蛋白的一種，其蛋白分子可通過特定的跨膜結構“錨泊”在細胞表面，主要組分是由約20個氨基酸構成的不定數串列重復區構成的獨立的胞外域。該蛋白結構簡單清晰，易被免疫細胞所呈遞和識別[7]。同時，MUC1的表達具有高度的腫瘤特異性，在胰腺癌組織中的陽性表達率可達90%以上[2]，因此被認為是腫瘤免疫治療的一個重要靶點。

本研究顯示，來自健康志愿者和胰腺癌患者的DC轉染MUC1 mRNA后誘導的CTL免疫反應強度近乎相同。原因可能是引入的抗原負荷量不足。

MUC1特異性CTL只能識別和殺傷HLA-A2+/MUC1+的靶細胞。而對HLA-A2-/MUC1+的MiaPaCa-2細胞以及HLA-A2-/MUC1-的轉染有自體(PBMC)或無關組織(GFP)RNA的DC未引出特異性免疫殺傷效應。提示MUC1特異性CTL免疫反應受到MHC I類抗原呈遞的限制。

總之，本研究將擴增的MUC1 mRNA轉染DC，在體外成功誘導出了針對胰腺癌細胞的MUC1特異性CTL免疫反應，為MUC1 DC疫苗的構建與應用提供了理論和實驗基礎。

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Inductionofspecificanti-tumorimmuneresponsesagainstpancreaticcancerbytransfecteddendriticcellswithpancreaticcancerMUC1mRNA

CHENJiang,GUOXiao-zhong,LIHong-yu,SHAOXiao-dong,LIUXu,ZHAOJia-jun,WANGDi.

DepartmentofGastroenterological,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840,China

GUOXiao-zhong,Email:Guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the induction of specific anti-tumor immune response by transfected dendritic cells (DCs) with MUC1 mRNA of human pancreatic cancer, and to provide the experimental evidences for the treatment of human pancreatic cancer with DC vaccine.MethodsDCs were isolated and cultured from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and then were identified by cell morphology and surface markers. After being transcripted and amplified, MUC1 mRNA was transfected into DCs by electroporation. The expression of MUC1 in DCs at different time points was detected by quantitative real-time PCR and Western blot. The survival rate of DCs before and after transfection was determined by MTT method. The induction of specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) response by MUC1 mRNA transfected DCs was measured by51Cr standard cytotoxicity test. The released amount of IFN-γ was evaluated by ELISA method.ResultsThe cultured cells appeared typical characteristics with regard to morphology and phenotype (CD40+, HLA-DR+, CD83+, CD86+). After MUC1 mRNA transfection for 48 h, the expression of MUC1 mRNA of DCs reached the highest point (38.43) and the MUC1 protein expression also reached the highest point at 72 h. The survival rate of DCs was stabilized around 80% after transfection. The DCs transfected with MUC1 mRNA could effectively induce HLA-A2+/MUC1+specific CTL immune responses. Stimulated by pancreatic cancer cell line Capan-2 cells or the DCs transfected with MUC1 mRNA, the IFN-γ released in 24 h by MUC1 specific CTL were (28.44±4.96)U/ml and (16.31±2.54)U/ml, respectively. The difference between the two groups was statistically significant (P<0.05).ConclusionsDCs transfected with human pancreatic cancer MUC1 mRNA could induce CTLs and produce specific anti-tumor immunity.

Dendritic cells; RNA, messenger; Transfection; Pancreatic neoplasms; T-lymphocytes, cytotoxic

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.004

國家自然科學基金(81071982)

110016 沈陽，沈陽軍區總醫院消化科

郭曉鐘，Email:guoxiaozhong1962@163.com

2012-02-02)

(本文編輯：屠振興)