Toll樣受體4在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系

滿曉華 孫運良 龔燕芳 吳紅玉 李兆申

·論著·

Toll樣受體4在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系

滿曉華 孫運良 龔燕芳 吳紅玉 李兆申

目的探討Toll樣受體4(TLR4)在胰腺癌組織中的表達及其與腫瘤血管生成的關系。方法采用免疫組化SP法檢測62例經病理證實的胰腺癌手術切除標本及35例癌旁正常胰腺組織中TLR4蛋白表達，采用CD31抗體標記微血管內皮細胞，計算微血管密度(MVD)。分析TLR4蛋白表達與胰腺癌臨床病理特征以及MVD的相關性。結果胰腺癌組織TLR4蛋白陽性表達率和MVD分別為74.2%(46/62)和47.3±13.5，均顯著高于正常胰腺組織的17.1%(6/35)和12.6±4.8(P值均<0.01)。有淋巴結轉移的胰腺癌組織中TLR4蛋白陽性表達率為83.8%，顯著高于無淋巴結轉移的60.0%(P=0.036)；TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胰腺癌組織中TLR4蛋白陽性表達率為85.3%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期的60.7%(P=0.028)。MVD與腫瘤的大小、淋巴結轉移及TNM分期密切相關(P值分別為0.008、0.036、0.010)。胰腺癌TLR4蛋白表達與MVD呈顯著正相關(γ=0.534，P<0.01)。結論TLR4參與胰腺癌的發生、發展，其機制可能與促進腫瘤血管生成有關。

Toll樣受體4； 胰腺腫瘤； 血管生成，病理性； 免疫組織化學

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是最早發現的、同時也是研究最為廣泛的TLR家族成員。近年來研究發現，TLR4在多種腫瘤細胞中呈高表達，參與了腫瘤的發生與發展[1]。本研究檢測胰腺癌組織的TLR4蛋白表達，分析其與胰腺癌臨床病理特征及微血管密度(microvessel density，MVD)的關系，探討其在胰腺癌發生、發展中的作用。

材料和方法

一、標本來源

收集2006年1月至2010年12月長海醫院手術切除并經病理證實且資料完整的胰腺導管腺癌標本62例，所有患者手術前均無化療、放療或其他針對腫瘤的治療。另選擇35例距腫瘤5 cm以上且經病理證實為正常胰腺的癌旁組織標本作為對照。

二、TLR4及MVD檢測

采用免疫組化染色超敏兩步法(SP染色法)，按SP免疫組化試劑盒(福州市邁新生物技術開發公司)說明書操作。兔抗人TLR4多抗(Santa Cruz公司)工作濃度1∶200，小鼠抗人CD31單抗(Neo makers公司)工作濃度1∶100。用已知TLR4表達強陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，以PBS替代一抗作陰性對照。

TLR4陽性染色為胞膜和胞質出現棕黃色顆粒。采用雙盲法隨機觀察5個高倍視野。評分標準：陽性細胞率≤5%為0分，6%～29%為1分，30%～59%為2分，≥60%為3分；無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩分相乘，≤1分為陰性，2分為弱陽性，3～4分為中等度陽性，≥5分為強陽性。

CD31主要表達于血管內皮細胞膜，任何被染成棕色的血管內皮細胞或細胞簇均作為一個血管計數，只要結構不相連,其分支結構也作為一個血管計數,厚壁血管或管徑>50 μm的血管則排除在外。先在低倍鏡下選擇血管密集區，然后高倍鏡下隨機計數5個視野內微血管數，取其均值為MVD。

三、統計學方法

結 果

一、胰腺癌與癌旁組織TLR4表達及MVD

癌旁正常胰腺組織TLR4表達陰性29例，弱陽性5例，中等度陽性1例，陽性表達率為17.1%；胰腺癌組織TLR4表達陰性16例，弱陽性9例，中等度陽性22例，強陽性15例，陽性表達率為74.2%(圖1)，兩者差異具有統計學意義(P<0.01)。

腫瘤組織最密集血管染色區域主要位于癌灶邊緣(圖2)。胰腺癌組織MVD為47.3±13.5，顯著高于癌旁組織的12.6±4.8(P<0.01)。

圖1 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)TLR4表達(SP ×400)

圖2 胰腺癌(a)和癌旁組織(b)CD31表達(SP ×200)

二、TLR4表達、MVD與胰腺癌臨床病理特征的關系

胰腺癌組織TLR4表達與胰腺癌患者的年齡、性別及腫瘤部位、大小、分化程度均無關，而與淋巴結轉移、TNM分期相關。MVD與胰腺癌患者的年齡、性別及腫瘤部位、分化程度均無關，而與腫瘤的大小、淋巴結轉移及TNM分期相關(表1)。

表1 TLR4表達、MVD與胰腺癌臨床病理特征的關系

三、胰腺癌組織TLR4表達與MVD的相關性

胰腺癌組織TLR4表達陰性、弱陽性、中等度陽性和強陽性組的MVD分別為36.4±6.9、47.4±13.6、48.4±11.9和57.2±13.5，組間差異有統計學意義(F=8.521，P<0.01)。TLR4表達與MVD呈顯著正相關(γ=0.534，P<0.01，圖3)。

圖3 胰腺癌組織TLR4表達和MVD的相關性

討 論

TLRs是近年來發現的I型跨膜蛋白質,它通過識別病原相關的分子模式及某些內源性配體引發信號轉導，引起炎癥介質的釋放，被公認為天然免疫系統中最重要的一類受體家族，其中TLR4是目前研究相對較為成熟的TLR家族成員。TLR4除了在免疫細胞表達外，還在腫瘤細胞高表達，與多種腫瘤的發生、發展密切相關[2]。Szajnik等[3]報道，TLR4在卵巢癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織。Wang等[4]報道，TLR4在結腸癌組織中呈顯著高表達，且與肝轉移及腫瘤的TNM分期密切相關。本研究結果也顯示，胰腺癌組織TLR4高表達，且與胰腺癌的TNM分期以及淋巴結轉移密切相關，提示TLR4在胰腺癌的發生與發展中起著重要的作用。

實體腫瘤的生長需要血管來提供營養和排泄自身代謝產物。當腫瘤體積<1 mm3時，這一過程可通過組織滲透來完成；隨著瘤體的增大，腫瘤本身或宿主組織將建立新生血管網以供給瘤體營養。Riddell等[5]報道，TLR4被激活后可調控VEGF的表達，促進血管內皮細胞的增殖、遷移和分化，導致血管生成增加。本結果顯示，胰腺癌組織MVD顯著高于正常胰腺組織，MVD與腫瘤的TNM分期和淋巴結轉移密切相關，且TLR4表達和MVD呈顯著正相關，提示TLR4可能通過促進腫瘤血管的生成參與胰腺癌的發生和發展過程。

[1] Ghaneh P, Costello E, Neoptolemos JP. Biology and management of pancreatic cancer. Postgrad Med J, 2008, 84:478-497.

[2] Rakoff-Nahoum S, Medzhitov R.Toll-like receptors and cancer. Nat Rev Cancer, 2009, 9:57-63.

[3] Szajnik M,Szczepanski MJ,Czystowska M,et al.TLR4 signaling induced by lipopolysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer.Oncogene,2009,28:4353-4363.

[4] Wang EL,Qian ZR,Nakasono M,et al.High expression of Toll-like receptor 4/myeloid differentiation factor 88 signals correlates with poor prognosis in colorectal cancer.Br J Cancer,2010,102:908-915.

[5] Riddell JR,Bshara W,Moser MT,et al.Peroxiredoxin 1 controls prostate cancer growth through Toll-like receptor 4-dependent regulation of tumor vasculature.Cancer Res,2011,71:1637-1646.

RelationshipbetweenTLR4expressionandangiogenesisinhumanpancreaticadenocarcinoma

MANXiao-hua,SUNYun-liang,GONGYan-fang,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate Toll-like receptor-4(TLR4) protein expression in human pancreatic adenocarcinoma, and to evaluate the relationship between TLR4 protein expression and angiogenesis.MethodsSixty-two surgically resected human pancreatic adenocarcinoma specimens and 35 normal para-cancerous tissues were investigated for TLR4 protein expression by immunohistochemical SP methods, and CD31antibody was used to mark microvascular endothelial cells and determine the microvessel density (MVD). The correlation among TLR4 protein expression and MVD and clinicopathologic features of pancreatic adenocarcinoma were analyzed.ResultsTLR4 protein positive expression rate and MVD in human pancreatic adenocarcinoma was 74.2%(46/62) and 47.3±13.5, respectively, which were significantly higher than those in the normal pancreatic tissue [17.1%(6/35), 12.6±4.8;P<0.01]. TLR4 protein positive expression rate in the cases with lymph node metastasis was 83.8%, which was significantly higher than that in the cases without lymph node metastasis (60.0%,P=0.036). TLR4 protein positive expression rate in the patients with stage III and IV of TNM classification was 85.3%, which was significantly higher than that in the patients with stage I and II (60.7%,P=0.028). MVD was closely related to tumor size, lymph node metastasis and TNM stage of pancreatic adenocarcinoma (P=0.008, 0.036, 0.010). There was a strong positive correlation between TLR4 protein expression and MVD (r=0.534,P<0.01).ConclusionsTLR4 protein expression is closely related to the development and progression of human pancreatic adenocarcinoma and its potential mechanism is related to the promotion of tumor angiogenesis.

Toll-like receptor 4; Pancreatic neoplasms; Angiogenesis, pathologic; Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.008

210043 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科(滿曉華、龔燕芳、吳紅玉、李兆申)；江蘇省贛榆縣人民醫院消化內科(孫運良)

共同第一作者：孫運良

李兆申，Email：zhsli@81890.net

2011-12-20)

(本文編輯：屠振興)