溫和高溫下胰腺癌細胞株PANC1對吉西他濱耐藥性的影響

劉明浩 李淑德 李兆申 高軍 吳洪玉 龔艷芳

·論著·

溫和高溫下胰腺癌細胞株PANC1對吉西他濱耐藥性的影響

劉明浩 李淑德 李兆申 高軍 吳洪玉 龔艷芳

目的觀察溫和高溫下胰腺癌細胞株PANC1對吉西他濱敏感性的影響。方法應用1 μmol/L吉西他濱處理胰腺癌PANC1細胞1 h后，分別置37、42、45℃水浴鍋孵育1 h，再繼續培養0、24、48 h。采用CCK-8法檢測細胞增殖，AV/PI染色后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果42℃及45℃孵育細胞24、48 h后的細胞增殖均較37℃孵育的細胞顯著降低(0.96±0.05、0.88±0.03比1.05±0.02；1.28±0.04、0.94±0.04比1.49±0.09；t值分別為4.367、25.120、3.510、12.101，P值均<0.05)，且45℃孵育的細胞增殖顯著低于42℃孵育的細胞(t值分別為3.348、11.732，P值均<0.05)。37、42、45℃孵育的吉西他濱處理的PANC1細胞48 h后的細胞凋亡率分別為(7.125±0.064)%、(9.985±0.615)%、(14.845±1.987)%，3組間的差異均具有統計學意義(t值分別為10.320、9.832、4.575，P值均<0.05)。結論溫和高溫可以增加PANC1細胞對吉西他濱的敏感性。

胰腺腫瘤； 溫和高溫； 吉西他濱； 藥物療法

胰腺癌患者手術切除率低，對放、化療不敏感，生存期短[1]。文獻報道，溫和高溫(mild temperature hyperthermia)(40～45℃,1～2 h)處理腫瘤細胞可提高其對化療藥物的敏感性[2-3]。近期文獻報道，局部高溫處理(42℃，30 min)腫瘤聯合化療治療的胰腺癌患者平均生存期長于僅化療的患者[4]。為此，本研究觀察溫和高溫聯合吉西他濱對胰腺癌細胞耐藥性的影響，為溫和高溫的臨床應用提供實驗依據。

材料和方法

一、溫和高溫聯合吉西他濱處理PANC1細胞

PANC1胰腺癌細胞株購于中國科學院細胞庫，常規培養傳代。取對數生長期細胞接種于96孔板，每孔加入5×104個細胞(100 μl)，應用1 μmol/L吉西他濱(法國禮來公司生產，每支200 mg,批號：A674393A)處理細胞。將處理后細胞分別置于37、42、45℃水浴鍋孵育1 h，再繼續常規培養0、24、48 h。每組每時間點設6個復孔。

二、細胞增殖檢測

將上述各組各時間點細胞去培養液，每孔加入10 μl CCK-8(Dojindo公司)溶液，再加入90 μl DMEM培養液繼續孵育4 h，應用自動酶標儀測各孔450 nm處吸光度值(A450)。

三、細胞凋亡檢測

將溫和高溫聯合吉西他濱處理的細胞繼續培養48 h，收集細胞，調整細胞數為5×106/ml。應用70%乙醇固定后置-20℃過夜，用PBS洗滌2次后應用Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide(eBioscienc)試劑處理細胞，上流式細胞儀分析細胞凋亡率。

四、統計學分析

結 果

一、胰腺癌PANC1細胞增殖的改變

37℃孵育組PANC1細胞在0、24、48 h時的A450值分別為0.68±0.01、1.05±0.02、1.49±0.09；42℃孵育組分別為0.68±0.02、0.96±0.05、1.28±0.04；45℃孵育組分別為0.68±0.02、0.88±0.03、0.94±0.04。42℃及45℃孵育24 h后的細胞增殖較37℃顯著降低(t=4.367,P<0.05;t=25.120,P<0.01)；孵育48 h的細胞增殖亦較37℃顯著降低(t=3.510,P<0.05;t=12.101,P<0.01)。同時，45℃孵育的細胞增殖顯著低于42℃孵育的細胞(t=3.348,P<0.05;t=11.732,P<0.01)。

二、胰腺癌PANC1細胞凋亡的變化

顯微鏡下見42、45℃孵育組的懸浮細胞明顯多于37℃組(圖1)。37、42、45℃孵育48 h后的PANC1細胞的凋亡率分別為(7.125±0.064)%、(9.985±0.615)%、(14.845±1.987)%(圖2)。37℃孵育組的細胞凋亡率顯著低于42℃組(t=10.320,P<0.05)及45℃組(t=9.832,P<0.05);42℃組又顯著低于45℃組(t=4.575,P<0.05)。

圖1不同溫度孵育吉西他濱處理的PANC1細胞48 h的細胞形態(×100)

圖237(a)、42(b)、45℃(c)孵育吉西他濱處理的PANC1細胞48 h的細胞凋亡 (流式細胞儀)

討 論

溫度對腫瘤影響的研究可以追溯到1970年。當時發現當達到一定溫度時細胞會被阻滯在不同細胞周期，進而死亡。導致細胞死亡的溫度是有特異性的，不同細胞可以耐受不同的溫度。之后發現細胞的死亡主要原因是高溫促使蛋白變性。如果使腫瘤組織蛋白變性壞死，溫度至少要達到或超過60℃，但臨床上使腫瘤組織達到或超過該溫度并不容易，且該溫度作用于人體的安全性較差。為此，有學者對溫和高溫處理腫瘤組織是否可以提高化療的敏感性進行了研究,結果顯示溫和高溫聯合化療處理軟組織肉瘤可以提高患者平均生存期。將發生轉移的軟組織肉瘤患者整體溫度提高到41.8℃維持1 h可以使患者對化療藥物的敏感性提高24%[5-6]，維持機體39～40℃ 4～6 h可以達到抗腫瘤的效果[7]。Adachi等[8]發現，高溫(43℃ 1 h)可以誘導胰腺癌細胞熱休克蛋白70表達，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。有學者報道，提高機體溫度可以增加腫瘤組織血流及血管通透性，使化療藥物更容易作用于腫瘤細胞，從而達到增加其對化療藥物的敏感性。但有學者認為，高溫對微血管的損傷及增加細胞間質的壓力可能會抵消這種血流增加的作用[9]。因而溫度對提高化療藥物敏感性的機制尚未十分明確。

本研究結果顯示，溫和高溫聯合吉西他濱處理能明顯抑制胰腺癌細胞的增殖，增加細胞的凋亡率，表明溫和高溫聯合吉西他濱能提高胰腺癌PANC1細胞對吉西他濱的敏感性。雖然，45℃較42℃的效果更好，但臨床將患者局部溫度加熱到45℃時的安全性較差。42℃高溫相比傳統高溫(>45℃)應用于臨床有其明顯的優勢。首先，42℃高溫可以作用患者全身，不會出現傳統高溫治療腫瘤所發生的遺漏腫瘤細胞，導致腫瘤復發；其次，42℃高溫操作簡便，可以使用水浴及紅外設備直接加熱患者，不必進行有創操作；最后，42℃高溫可以提高腫瘤患者對化療藥物的敏感性，延長患者的預后，有效地平衡了治療的有效性及安全性。

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[3] Westermann AM, Wiedemann GJ, Jager E, et al. A Systemic Hyperthermia Oncologic Working Group trial. Ifosfamide, carboplatin, and etoposide combined with 41.8 degrees C whole-body hyperthermia for metastatic soft tissue sarcoma. Oncology,2003,64:312-321.

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[9] Jain RK. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science,2005,307:58-62.

MildhyperthermiaaffectschemoresistanceofgemcitabineinpancreaticcancerPANC1cellline

LIUMing-hao,LIShu-de,LIZhao-shen,GAOJun,WUHong-yu,GONGYan-fang.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhaoshenli@hotmail.com；LIShu-de,Email:lishude57@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of mild hyperthermia on chemoresistance of gemcitabine in the pancreatic cancer cell line PANC1.MethodsThe PANC1 cell was treated with gemcitabine (1 μmol/L) for 1 h, then was heated at 37℃, 42℃ and 45℃ for 1 hour, and was cultured for 0 h, 24 h, 48 h. Cell growth was analyzed by CCK-8 assay. Cell apoptosis was analyzed by Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) staining.ResultsThe proliferation of cells at 42℃ and 45℃ for 24 h and 48 h were significantly lower than that at 37℃(0.96±0.05,0.88±0.03vs1.05±0.02；1.28±0.04,0.94±0.04vs1.49±0.09；t=4.367, 25.120,P<0.05). The proliferation of cells at 45℃ was significantly lower than that at 42℃(t=3.348, 11.732,P<0.05).The cell apoptosis rates at 37℃, 42℃, 45℃ after 48 h were (7.125±0.064)%, (9.985±0.615)%, (14.845±1.987)%, the difference among the 3 groups was statistically significant (t=10.320, 9.832, 4.575,P<0.05).ConclusionsMild hyperthermia can reduce chemoresistance of gencitabine in pancreatic cancer cell PANC1.

Pancreatic neoplasms; Mild hyperthermia; Gemcitabine; Drug therapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.03.014

上海衛生局科研基金

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email:zhaoshenli@hotmail.com；李淑德，Email:lishude57@126.com

2011-12-19)

(本文編輯：屠振興)