Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流、提高大鼠血管鈣敏感性中的作用*

趙自剛， 牛春雨， 魏艷玲， 張玉平， 司永華， 張 靜

(河北北方學院微循環研究所，基礎醫學院病理生理學教研室，河北 張家口 075029)

1000-4718(2012)01-0011-05

2011-07-29

2011-11-07

國家自然科學基金資助項目(No.30971203)

△通訊作者 Tel: 0313-4029168; E-mail：ncylxf@126.com

Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流、提高大鼠血管鈣敏感性中的作用*

趙自剛， 牛春雨△， 魏艷玲， 張玉平， 司永華， 張 靜

(河北北方學院微循環研究所，基礎醫學院病理生理學教研室，河北 張家口 075029)

目的觀察Rho激酶在腸淋巴管結扎或腸淋巴液引流提高失血性休克大鼠血管鈣敏感性中的作用。方法Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組(sham)、失血性休克組(shock)、休克腸淋巴管結扎組(shock+ligation，行腸淋巴管結扎)、休克腸淋巴液引流組(shock+drainage，行腸淋巴液引流)，在休克3 h或sham組的相應時點，制備腸系膜上動脈(SMA)血管環，采用離體血管環張力測定技術，觀察SMA血管環對梯度鈣離子收縮性的變化；shock+ligation與shock+drainage組SMA血管環分別與Rho激酶激動劑血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、抑制劑fasudil孵育后，觀察鈣敏感性變化。結果Shock組SMA血管環的鈣敏感性顯著低于sham組；shock+ligation組與shock+drainage組SMA血管環鈣敏感性顯著高于shock組，但低于sham組。Shock+ligation組與shock+drainage組SMA血管環與AngⅡ或fasudil孵育后，AngⅡ不同程度地提高了shock+ligation組與shock+drainage組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的收縮性與pD2；fasudil顯著降低了兩組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的收縮性與最大收縮力Emax，降低了shock+ligation組的pD2。結論Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中發揮重要作用。

休克，出血性； 腸淋巴管； 結扎術； 腸淋巴液； 引流術； 鈣敏感性； Rho激酶

研究表明，休克腸淋巴液回流是進一步加重組織器官損傷的重要因素[1-3]，結扎休克大鼠的腸淋巴管或行腸淋巴液引流，均可減少重要器官組織炎癥因子的產生，降低自由基損傷，改善組織器官功能[4-6]；血管低反應性是休克難以治愈的重要因素[7-8]，以腸淋巴管結扎或腸淋巴液引流阻斷休克腸淋巴液回流，均可提高失血性休克(hemorrhagic shock，HS)大鼠的血管反應性，其機制與提高血管鈣敏感性有關[9]；Rho激酶參與了失血性休克后血管低反應性與鈣敏感性的調節[10-12]，而阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性的機制是否與Rho激酶有關？值得研究。本文研究目的在于觀察Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中的作用。

材 料 和 方 法

1動物及分組

SPF級Wistar雄性大鼠30只，體重260～320 g(中國醫科院實驗動物繁殖中心)。所有大鼠實驗前12 h禁食、自由飲水，隨機分為假手術組(sham，n=6)、失血性休克組(shock，n=6)、休克腸淋巴管結扎組(shock+ligation，n=9)、休克腸淋巴液引流組(shock+drainage，n=9)。

2方法

大鼠肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)全身麻醉后，分離右側股動脈和股靜脈，股動脈插三通管，一端連接RM6240BD型生物信號采集系統(成都儀器廠)，用于監測平均動脈血壓(mean blood pressure, MAP)，另一端用于放血，股靜脈插管用于肝素化抗凝(500 U/kg)；行腹部手術，仔細分離腸淋巴管(mesentery lymph duct, MLD)與腸系膜上動脈(super mesenteric artery, SMA)；術后穩定30 min，10 min內放血使MAP至40 mmHg，維持3 h，復制大鼠重癥休克模型。Shock+ligation組與shock+drainage組分別于放血前用我室常規方法行腸淋巴管結扎術和腸淋巴液引流術，sham組和shock組只在MLD下穿線不結扎。

3離體血管環制備

Shock組、shock+ligation組與shock+drainage組動物在維持3 h后、sham組動物在相應時點，迅速取出SMA，清除血管周圍脂肪結締組織，每只大鼠制備2根SMA血管環，長約2～3 mm；取sham組和shock組的12根血管環中不屬于同一動物的6根用于鈣敏感性測定(剩余6根用于其它實驗)，shock+ligation組與shock+drainage組制備的18根血管環中，不屬于同一動物的6根不作處理、6根與血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ，10-9mol/L，Sigma)孵育(作為ligation+ AngⅡ組或drainage+AngⅡ組)、6根與法舒地爾(fasudil，10-6mol/L，Alexis)孵育(作為ligation+ fasudil組或drainage+fasudil組)。

4鈣敏感性觀察

將SMA血管環掛于四腔離體血管器官灌流系統(成都儀器廠)的浴槽中，一端固定于槽底部，另一端通過張力換能器與生物信號采集系統相連，浴槽內液體為5 mL 37 ℃的K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)液，持續充入95%O2和5%CO2混合氣體；孵育1.5 h后換高鉀液(NaCl 2.7 mmol/L、KCl 120 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)孵育15 min；ligation+ AngⅡ組、drainage+AngⅡ組、ligation+fasudil組、drainage+fasudil組分別與相關工具藥預孵育10 min后，再換高鉀液孵育15 min。待張力曲線穩定后，以濃度累積法依次加入不同濃度的Ca2+，使其終濃度依次為3×10-5、10-4、3×10-4、10-3、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L，記錄不同Ca2+濃度下血管環產生的最大收縮力(Emax)，以g/mg為量化標準，制作量效曲線，用曲線擬合法求Ca2+的EC50，用Ca2+達到50%最大反應時的負對數pD2(-lg[EC50])和Emax以及量效曲線評價血管的鈣敏感性。

5統計學處理

結 果

1Rho激酶在腸淋巴管結扎提高休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

Shock組SMA血管環對梯度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2顯著低于sham組(P<0.01)；shock+ligation組SMA血管環對各梯度鈣離子的收縮性、Emax值顯著高于shock組(P<0.01)，但對梯度鈣離子(自10-4mol/L起)的收縮性、Emax值和pD2仍顯著低于sham組(P<0.01)。Shock+ligation組SMA血管環與Rho激酶激動劑AngⅡ孵育后，對梯度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2均分別顯著高于shock組，對鈣離子(濃度為10-4、3×10-3、10-3mol/L時)的收縮性、pD2顯著高于shock+ligation組，且對鈣離子(濃度為10-4、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L時)的收縮性及Emax值顯著低于、pD2高于sham組(P<0.05，P<0.01)。與Rho激酶抑制劑fasudil孵育后，對梯度鈣離子的敏感性、Emax值和pD2均顯著低于sham組、shock+ligation組和ligation+AngⅡ組(P<0.01)，與shock組比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1Rho激酶在腸淋巴管結扎調節休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

表1Rho激酶在腸淋巴管結扎調節休克大鼠SMA血管環對鈣離子Emax與pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．87±0．123．59±0．11Shock0．44±0．09??3．30±0．22??Shock+ligation0．66±0．10??##3．43±0．15Ligation+AngⅡ0．68±0．03??##3．76±0．09??##△△Ligation+fasudil0．44±0．03??△△▲▲3．20±0．12??△△▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+ligation;▲▲P<0.01vsligation+AngⅡ.

2Rho激酶在腸淋巴液引流提高休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

如表2、圖2示，shock+drainage組SMA血管環對梯度鈣離子(自10-4mol/L起)的收縮性、Emax值顯著高于shock組(P<0.05，P<0.01)，但對各濃度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2仍顯著低于sham組(P<0.01)；shock+drainage組SMA血管環與Rho激酶激動劑AngⅡ孵育后，對梯度鈣濃度的收縮性、Emax值和pD2顯著高于shock組，對鈣離子(濃度為3×10-5、10-4、3×10-4、10-3mol/L時)的收縮性和pD2顯著高于shock+drainage組，對鈣離子(濃度為3×10-3、10-2、3×10-2mol/L時)的收縮性和Emax值低于sham組、pD2高于sham組(P<0.01)；與Rho激酶抑制劑fasudil孵育后，除鈣離子濃度為3×10-5mol/L時與shock+drainage組比無顯著差異外，對梯度鈣離子的敏感性和Emax值均顯著低于sham組、shock+drainage組和drainage+AngⅡ組，pD2顯著低于sham組和drainage+AngⅡ組(P<0.05，P<0.01)，與shock組相比均無顯著差異(P>0.05)。

討 論

隨著對休克血管低反應性發生機制的深入研究，發現收縮性的高低不僅取決于血管平滑肌細胞內鈣離子濃度，而且與鈣的有效利用有著密切的關系；休克晚期血管平滑肌細胞內存在鈣超載，并非低鈣，說明鈣敏感性降低參與了血管低反應性的形成[11]。徐競等[12]復制失血性休克大鼠模型，以Rho為切入點，發現失血性休克血管存在鈣敏感性降低的現象，Rho激酶激動劑可顯著提高失血性休克大鼠血管的鈣敏感性，而Rho激酶拮抗劑可顯著降低鈣敏感性。這些研究均表明鈣失敏是失血性休克后血管低反應性的重要因素，且Rho激酶參與了失血性休克后鈣失敏的發生。

圖2Rho激酶在腸淋巴液引流調節休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

表2Rho激酶在腸淋巴液引流調節休克大鼠SMA血管環對鈣離子Emax與pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．868±0．1223．588±0．113Shock0．444±0．092??3．295±0．220??Shock+drainage0．655±0．052??##3．284±0．076??Drainage+AngⅡ0．663±0．011??##3．830±0．030??##△△Drainage+fasudil0．433±0．098??△△▲▲3．239±0．208??▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+drainage;▲▲P<0.01vsdrainage+AngⅡ.

本文在已證實休克腸淋巴液回流是失血性休克大鼠血管反應性與鈣敏感性降低的重要機制[9]的基礎上，進一步使用Rho激酶工具藥與執行腸淋巴管結扎或腸淋巴液引流后大鼠的SMA血管環共孵育，應用離體血管環張力測定技術，發現Rho激酶激動劑AngⅡ可不同程度地提高腸淋巴管結扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子(尤其是在較低的幾個鈣離子濃度點)的收縮性與pD2；Rho激酶抑制劑fasudil則顯著降低了腸淋巴管結扎或腸淋巴液引流后大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的收縮性與最大收縮力Emax，降低了腸淋巴管結扎組的pD2。研究結果提示，Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中發揮一定的作用。

本研究也發現，AngⅡ對腸淋巴管結扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的Emax均未發揮作用，但fasudil卻顯著降低了兩組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的Emax，這也說明除Rho激酶發揮的作用之外，還可能存在其它因素的作用。有研究報道，肌球蛋白輕鏈(20-kD myosin light chain，MLC20)磷酸化水平與血管平滑肌鈣敏感性的調節密切相關，Rho激酶和PKC均可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)活性，提高MLC20磷酸化水平，從而提高血管鈣敏感性[13-15]。PKC、Rho激酶及其與MLC20磷酸化的關系在阻斷休克腸淋巴液回流提升血管鈣敏感性中的作用如何，還有待進一步觀察。

同時，本研究也發現，腸淋巴管結扎組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的pD2與sham組比無明顯差異，而腸淋巴液引流組仍顯著低于sham組；AngⅡ提高了腸淋巴管結扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環對梯度鈣離子的pD2；fasudil僅降低了腸淋巴管結扎組的pD2，但對腸淋巴液引流組pD2無明顯作用。結果表明，腸淋巴管結扎提高血管鈣敏感性的作用要強于腸淋巴液引流，其機制是否與腸淋巴液引流減少部分容量有關，還是有其它原因，還不清楚。

應當指出，阻斷腸淋巴液提高了血管鈣敏感性，而應用fasudil則拮抗了阻斷休克腸淋巴液回流升高血管鈣敏感性的這一作用，說明阻斷腸淋巴液提高血管鈣敏感性的作用與fasudil有關，而fasudil是Rho激酶的特異性拮抗劑，它的藥理學作用是通過抑制Rho激酶來實現的[16-17]，這說明阻斷休克腸淋巴液回流的作用與Rho激酶有關。而阻斷休克腸淋巴液回流對SMA組織Rho激酶活性的影響有待在今后的實驗中進一步觀察。

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RoleofRhokinaseinblockingthereturnofmesentericlymphtoimprovevascularcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

ZHAO Zi-gang, NIU Chun-yu, WEI Yan-ling, ZHANG Yu-ping, SI Yong-hua, ZHANG Jing

(InstituteofMicrocirculation,DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalInstitute,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com)

AIM: To observe the role of Rho kinase in mesenteric lymph duct ligation or mesenteric lymph drainage to improve vascular calcium sensitivity in the rats subjected to hemorrhagic shock.METHODSMale Wistar rats were randomly divided into sham group, shock group, shock+ligation (shock plus mesenteric lymph duct ligation) group and shock+drainage (shock plus mesenteric lymph drainage) group. After induction of shock (hypotension at 40 mmHg) for 3 h, the vascular rings of superior mesenteric artery (SMA) were prepared and used to measure the response to gradient calcium ions for determining the calcium sensitivity with a wire myograph system. In shock+ligation group and shock+drainage group, the vascular rings were incubated with Rho kinase agonist angiotensinⅡ or antagonist fasudil before the measurement of the response to gradient calcium ions.RESULTSThe calcium sensitivity of vascular rings in shock group was significantly lower than that in sham group, and that in shock+ligation group and shock+drainage group was significantly higher than that in shock group, but still lower than that in sham group. AngⅡ elevated the contractile activity of the vascular rings in response to gradient calcium ions and the pD2, and fasudil significantly decreased the response to gradient calcium ions and Emaxin shock+ligation group and shock+drainage group. At the same time, fasudil decreased the pD2in shock+ligation group.CONCLUSIONRho kinase plays an important role in blocking shock mesenteric lymph return that improves calcium sensitivity.

Shock,hemorrhagic; Mesenteric lymph duct; Ligation; Mesenteric lymph; Drainage; Calcium sensitivity; Rho kinase

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.003