Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流、提高大鼠血管鈣敏感性中的作用*

趙自剛， 牛春雨， 魏艷玲， 張玉平， 司永華， 張 靜

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 張家口 075029)

1000-4718(2012)01-0011-05

2011-07-29

2011-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30971203)

△通訊作者 Tel: 0313-4029168; E-mail：ncylxf@126.com

Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流、提高大鼠血管鈣敏感性中的作用*

趙自剛， 牛春雨△， 魏艷玲， 張玉平， 司永華， 張 靜

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 張家口 075029)

目的觀(guān)察Rho激酶在腸淋巴管結(jié)扎或腸淋巴液引流提高失血性休克大鼠血管鈣敏感性中的作用。方法Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、失血性休克組(shock)、休克腸淋巴管結(jié)扎組(shock+ligation，行腸淋巴管結(jié)扎)、休克腸淋巴液引流組(shock+drainage，行腸淋巴液引流)，在休克3 h或sham組的相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，制備腸系膜上動(dòng)脈(SMA)血管環(huán)，采用離體血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)，觀(guān)察SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子收縮性的變化；shock+ligation與shock+drainage組SMA血管環(huán)分別與Rho激酶激動(dòng)劑血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、抑制劑fasudil孵育后，觀(guān)察鈣敏感性變化。結(jié)果Shock組SMA血管環(huán)的鈣敏感性顯著低于sham組；shock+ligation組與shock+drainage組SMA血管環(huán)鈣敏感性顯著高于shock組，但低于sham組。Shock+ligation組與shock+drainage組SMA血管環(huán)與AngⅡ或fasudil孵育后，AngⅡ不同程度地提高了shock+ligation組與shock+drainage組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的收縮性與pD2；fasudil顯著降低了兩組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的收縮性與最大收縮力Emax，降低了shock+ligation組的pD2。結(jié)論Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中發(fā)揮重要作用。

休克，出血性； 腸淋巴管； 結(jié)扎術(shù)； 腸淋巴液； 引流術(shù)； 鈣敏感性； Rho激酶

研究表明，休克腸淋巴液回流是進(jìn)一步加重組織器官損傷的重要因素[1-3]，結(jié)扎休克大鼠的腸淋巴管或行腸淋巴液引流，均可減少重要器官組織炎癥因子的產(chǎn)生，降低自由基損傷，改善組織器官功能[4-6]；血管低反應(yīng)性是休克難以治愈的重要因素[7-8]，以腸淋巴管結(jié)扎或腸淋巴液引流阻斷休克腸淋巴液回流，均可提高失血性休克(hemorrhagic shock，HS)大鼠的血管反應(yīng)性，其機(jī)制與提高血管鈣敏感性有關(guān)[9]；Rho激酶參與了失血性休克后血管低反應(yīng)性與鈣敏感性的調(diào)節(jié)[10-12]，而阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性的機(jī)制是否與Rho激酶有關(guān)？值得研究。本文研究目的在于觀(guān)察Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中的作用。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物及分組

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠30只，體重260～320 g(中國(guó)醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心)。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、自由飲水，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham，n=6)、失血性休克組(shock，n=6)、休克腸淋巴管結(jié)扎組(shock+ligation，n=9)、休克腸淋巴液引流組(shock+drainage，n=9)。

2方法

大鼠肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)全身麻醉后，分離右側(cè)股動(dòng)脈和股靜脈，股動(dòng)脈插三通管，一端連接RM6240BD型生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠(chǎng))，用于監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓(mean blood pressure, MAP)，另一端用于放血，股靜脈插管用于肝素化抗凝(500 U/kg)；行腹部手術(shù)，仔細(xì)分離腸淋巴管(mesentery lymph duct, MLD)與腸系膜上動(dòng)脈(super mesenteric artery, SMA)；術(shù)后穩(wěn)定30 min，10 min內(nèi)放血使MAP至40 mmHg，維持3 h，復(fù)制大鼠重癥休克模型。Shock+ligation組與shock+drainage組分別于放血前用我室常規(guī)方法行腸淋巴管結(jié)扎術(shù)和腸淋巴液引流術(shù)，sham組和shock組只在MLD下穿線(xiàn)不結(jié)扎。

3離體血管環(huán)制備

Shock組、shock+ligation組與shock+drainage組動(dòng)物在維持3 h后、sham組動(dòng)物在相應(yīng)時(shí)點(diǎn)，迅速取出SMA，清除血管周?chē)窘Y(jié)締組織，每只大鼠制備2根SMA血管環(huán)，長(zhǎng)約2～3 mm；取sham組和shock組的12根血管環(huán)中不屬于同一動(dòng)物的6根用于鈣敏感性測(cè)定(剩余6根用于其它實(shí)驗(yàn))，shock+ligation組與shock+drainage組制備的18根血管環(huán)中，不屬于同一動(dòng)物的6根不作處理、6根與血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ，10-9mol/L，Sigma)孵育(作為ligation+ AngⅡ組或drainage+AngⅡ組)、6根與法舒地爾(fasudil，10-6mol/L，Alexis)孵育(作為ligation+ fasudil組或drainage+fasudil組)。

4鈣敏感性觀(guān)察

將SMA血管環(huán)掛于四腔離體血管器官灌流系統(tǒng)(成都儀器廠(chǎng))的浴槽中，一端固定于槽底部，另一端通過(guò)張力換能器與生物信號(hào)采集系統(tǒng)相連，浴槽內(nèi)液體為5 mL 37 ℃的K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)液，持續(xù)充入95%O2和5%CO2混合氣體；孵育1.5 h后換高鉀液(NaCl 2.7 mmol/L、KCl 120 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、glucose 11 mmol/L，pH 7.3～7.4)孵育15 min；ligation+ AngⅡ組、drainage+AngⅡ組、ligation+fasudil組、drainage+fasudil組分別與相關(guān)工具藥預(yù)孵育10 min后，再換高鉀液孵育15 min。待張力曲線(xiàn)穩(wěn)定后，以濃度累積法依次加入不同濃度的Ca2+，使其終濃度依次為3×10-5、10-4、3×10-4、10-3、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L，記錄不同Ca2+濃度下血管環(huán)產(chǎn)生的最大收縮力(Emax)，以g/mg為量化標(biāo)準(zhǔn)，制作量效曲線(xiàn)，用曲線(xiàn)擬合法求Ca2+的EC50，用Ca2+達(dá)到50%最大反應(yīng)時(shí)的負(fù)對(duì)數(shù)pD2(-lg[EC50])和Emax以及量效曲線(xiàn)評(píng)價(jià)血管的鈣敏感性。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1Rho激酶在腸淋巴管結(jié)扎提高休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

Shock組SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2顯著低于sham組(P<0.01)；shock+ligation組SMA血管環(huán)對(duì)各梯度鈣離子的收縮性、Emax值顯著高于shock組(P<0.01)，但對(duì)梯度鈣離子(自10-4mol/L起)的收縮性、Emax值和pD2仍顯著低于sham組(P<0.01)。Shock+ligation組SMA血管環(huán)與Rho激酶激動(dòng)劑AngⅡ孵育后，對(duì)梯度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2均分別顯著高于shock組，對(duì)鈣離子(濃度為10-4、3×10-3、10-3mol/L時(shí))的收縮性、pD2顯著高于shock+ligation組，且對(duì)鈣離子(濃度為10-4、3×10-3、10-2、3×10-2mol/L時(shí))的收縮性及Emax值顯著低于、pD2高于sham組(P<0.05，P<0.01)。與Rho激酶抑制劑fasudil孵育后，對(duì)梯度鈣離子的敏感性、Emax值和pD2均顯著低于sham組、shock+ligation組和ligation+AngⅡ組(P<0.01)，與shock組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

圖1Rho激酶在腸淋巴管結(jié)扎調(diào)節(jié)休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

表1Rho激酶在腸淋巴管結(jié)扎調(diào)節(jié)休克大鼠SMA血管環(huán)對(duì)鈣離子Emax與pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．87±0．123．59±0．11Shock0．44±0．09??3．30±0．22??Shock+ligation0．66±0．10??##3．43±0．15Ligation+AngⅡ0．68±0．03??##3．76±0．09??##△△Ligation+fasudil0．44±0．03??△△▲▲3．20±0．12??△△▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+ligation;▲▲P<0.01vsligation+AngⅡ.

2Rho激酶在腸淋巴液引流提高休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

如表2、圖2示，shock+drainage組SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子(自10-4mol/L起)的收縮性、Emax值顯著高于shock組(P<0.05，P<0.01)，但對(duì)各濃度鈣離子的收縮性、Emax值和pD2仍顯著低于sham組(P<0.01)；shock+drainage組SMA血管環(huán)與Rho激酶激動(dòng)劑AngⅡ孵育后，對(duì)梯度鈣濃度的收縮性、Emax值和pD2顯著高于shock組，對(duì)鈣離子(濃度為3×10-5、10-4、3×10-4、10-3mol/L時(shí))的收縮性和pD2顯著高于shock+drainage組，對(duì)鈣離子(濃度為3×10-3、10-2、3×10-2mol/L時(shí))的收縮性和Emax值低于sham組、pD2高于sham組(P<0.01)；與Rho激酶抑制劑fasudil孵育后，除鈣離子濃度為3×10-5mol/L時(shí)與shock+drainage組比無(wú)顯著差異外，對(duì)梯度鈣離子的敏感性和Emax值均顯著低于sham組、shock+drainage組和drainage+AngⅡ組，pD2顯著低于sham組和drainage+AngⅡ組(P<0.05，P<0.01)，與shock組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

討 論

隨著對(duì)休克血管低反應(yīng)性發(fā)生機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)收縮性的高低不僅取決于血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，而且與鈣的有效利用有著密切的關(guān)系；休克晚期血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)存在鈣超載，并非低鈣，說(shuō)明鈣敏感性降低參與了血管低反應(yīng)性的形成[11]。徐競(jìng)等[12]復(fù)制失血性休克大鼠模型，以Rho為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)失血性休克血管存在鈣敏感性降低的現(xiàn)象，Rho激酶激動(dòng)劑可顯著提高失血性休克大鼠血管的鈣敏感性，而Rho激酶拮抗劑可顯著降低鈣敏感性。這些研究均表明鈣失敏是失血性休克后血管低反應(yīng)性的重要因素，且Rho激酶參與了失血性休克后鈣失敏的發(fā)生。

圖2Rho激酶在腸淋巴液引流調(diào)節(jié)休克大鼠血管鈣敏感性中的作用

表2Rho激酶在腸淋巴液引流調(diào)節(jié)休克大鼠SMA血管環(huán)對(duì)鈣離子Emax與pD2中的作用

GroupEmax(kg/g)pD2Sham0．868±0．1223．588±0．113Shock0．444±0．092??3．295±0．220??Shock+drainage0．655±0．052??##3．284±0．076??Drainage+AngⅡ0．663±0．011??##3．830±0．030??##△△Drainage+fasudil0．433±0．098??△△▲▲3．239±0．208??▲▲

**P<0.01vssham;##P<0.01vsshock;△△P<0.01vsshock+drainage;▲▲P<0.01vsdrainage+AngⅡ.

本文在已證實(shí)休克腸淋巴液回流是失血性休克大鼠血管反應(yīng)性與鈣敏感性降低的重要機(jī)制[9]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用Rho激酶工具藥與執(zhí)行腸淋巴管結(jié)扎或腸淋巴液引流后大鼠的SMA血管環(huán)共孵育，應(yīng)用離體血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Rho激酶激動(dòng)劑AngⅡ可不同程度地提高腸淋巴管結(jié)扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子(尤其是在較低的幾個(gè)鈣離子濃度點(diǎn))的收縮性與pD2；Rho激酶抑制劑fasudil則顯著降低了腸淋巴管結(jié)扎或腸淋巴液引流后大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的收縮性與最大收縮力Emax，降低了腸淋巴管結(jié)扎組的pD2。研究結(jié)果提示，Rho激酶在阻斷休克腸淋巴液回流提高血管鈣敏感性中發(fā)揮一定的作用。

本研究也發(fā)現(xiàn)，AngⅡ?qū)δc淋巴管結(jié)扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的Emax均未發(fā)揮作用，但fasudil卻顯著降低了兩組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的Emax，這也說(shuō)明除Rho激酶發(fā)揮的作用之外，還可能存在其它因素的作用。有研究報(bào)道，肌球蛋白輕鏈(20-kD myosin light chain，MLC20)磷酸化水平與血管平滑肌鈣敏感性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，Rho激酶和PKC均可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)活性，提高M(jìn)LC20磷酸化水平，從而提高血管鈣敏感性[13-15]。PKC、Rho激酶及其與MLC20磷酸化的關(guān)系在阻斷休克腸淋巴液回流提升血管鈣敏感性中的作用如何，還有待進(jìn)一步觀(guān)察。

同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，腸淋巴管結(jié)扎組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的pD2與sham組比無(wú)明顯差異，而腸淋巴液引流組仍顯著低于sham組；AngⅡ提高了腸淋巴管結(jié)扎組或腸淋巴液引流組大鼠SMA血管環(huán)對(duì)梯度鈣離子的pD2；fasudil僅降低了腸淋巴管結(jié)扎組的pD2，但對(duì)腸淋巴液引流組pD2無(wú)明顯作用。結(jié)果表明，腸淋巴管結(jié)扎提高血管鈣敏感性的作用要強(qiáng)于腸淋巴液引流，其機(jī)制是否與腸淋巴液引流減少部分容量有關(guān)，還是有其它原因，還不清楚。

應(yīng)當(dāng)指出，阻斷腸淋巴液提高了血管鈣敏感性，而應(yīng)用fasudil則拮抗了阻斷休克腸淋巴液回流升高血管鈣敏感性的這一作用，說(shuō)明阻斷腸淋巴液提高血管鈣敏感性的作用與fasudil有關(guān)，而fasudil是Rho激酶的特異性拮抗劑，它的藥理學(xué)作用是通過(guò)抑制Rho激酶來(lái)實(shí)現(xiàn)的[16-17]，這說(shuō)明阻斷休克腸淋巴液回流的作用與Rho激酶有關(guān)。而阻斷休克腸淋巴液回流對(duì)SMA組織Rho激酶活性的影響有待在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀(guān)察。

[1] Deitch EA. Gut lymph and lymphatics: a source of factors leading to organ injury and dysfunction [J]. Ann N Y Acad Sci, 2010, 1207(Suppl 1): E103-E111.

[2] Fanous MY, Phillips AJ, Windsor JA. Mesenteric lymph: the bridge to future management of critical illness [J]. JOP, 2007, 8(4): 374-399.

[3] Zhang J, Niu CY, Zhao ZG. The lymphatic microcirculation & shock[M].∥ Zhao KS, Xu Q. Molecular mechanism of severe shock.1st ed.India: Research Signpost, 2009.131-155.

[4] 趙自剛,牛春雨,張 靜,等. 腸系膜淋巴管結(jié)扎對(duì)休克大鼠腎功能不全的干預(yù)機(jī)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24(4): 743-748.

[5] 牛春雨,趙自剛,張玉平,等. 淋巴液引流對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠多器官損傷的影響[J]. 中華創(chuàng)傷雜志, 2010, 26(12): 1144-1148.

[6] Lee MA, Yatani A, Sambol JT, et al. Role of gut-lymph factors in the induction of burn-induced and trauma-shock-induced acute heart failure [J]. Int J Clin Exp Med, 2008, 1(2): 171-180.

[7] 魏艷玲,牛春雨,趙自剛. 重癥休克血管低反應(yīng)性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)微循環(huán), 2009, 13(4): 317-321.

[8] 劉良明,李 濤,楊光明,等. 休克血管低反應(yīng)性發(fā)生的鈣失敏機(jī)制研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(10): 1980.

[9] 魏艷玲,牛春雨,趙自剛,等. 阻斷腸淋巴液回流提升失血性休克大鼠的血管反應(yīng)性和鈣敏感性[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(8): 1509-1514.

[10]Li T, Liu L, Liu J, et al. Mechanisms of Rho kinase re-gulation of vascular reactivity following hemorrhagic shock in rats [J]. Shock, 2008, 29(1): 65-70.

[11]Xu J, Liu LM. The role of calcium desensitization in vascular hyporeactivity and its regulation after hemorrhagic shock [J]. Shock, 2005, 23(6): 576-581.

[12]徐 競(jìng), 劉良明. 參與失血性休克血管鈣敏感性調(diào)節(jié)的信號(hào)分子[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2006, 22(5): 896-899.

[13]李 濤, 劉良明, 劉建倉(cāng). Rho激酶調(diào)節(jié)缺氧處理VSMC收縮反應(yīng)性與MLC20磷酸化的關(guān)系[J]. 中國(guó)急救醫(yī)學(xué), 2008, 28(1): 34-38.

[14]楊光明, 徐 競(jìng), 李 濤, 等. PKC -α、δ亞型在AVP改善缺氧處理VSMC反應(yīng)性中的作用及其與MLC20磷酸化調(diào)節(jié)的關(guān)系[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(1): 54-58.

[15]李 濤,徐 競(jìng),楊光明,等. RhoA調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性的機(jī)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(10): 1878-1882.

[16]Fujita H, Fukumoto Y, Saji K, et al. Acute vasodilator effects of inhaled fasudil, a specific Rho-kinase inhibitor, in patients with pulmonary arterial hypertension [J]. Heart Vessels, 2010, 25(2): 144-149.

[17]Yu JZ, Ding J, Ma CG, et al. Therapeutic potential of experimental autoimmune encephalomyelitis by Fasudil, a Rho kinase inhibitor [J]. J Neurosci Res, 2010, 88(8): 1664-1672.

RoleofRhokinaseinblockingthereturnofmesentericlymphtoimprovevascularcalciumsensitivityinhemorrhagicshockrats

ZHAO Zi-gang, NIU Chun-yu, WEI Yan-ling, ZHANG Yu-ping, SI Yong-hua, ZHANG Jing

(InstituteofMicrocirculation,DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalInstitute,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075029,China.E-mail:ncylxf@126.com)

AIM: To observe the role of Rho kinase in mesenteric lymph duct ligation or mesenteric lymph drainage to improve vascular calcium sensitivity in the rats subjected to hemorrhagic shock.METHODSMale Wistar rats were randomly divided into sham group, shock group, shock+ligation (shock plus mesenteric lymph duct ligation) group and shock+drainage (shock plus mesenteric lymph drainage) group. After induction of shock (hypotension at 40 mmHg) for 3 h, the vascular rings of superior mesenteric artery (SMA) were prepared and used to measure the response to gradient calcium ions for determining the calcium sensitivity with a wire myograph system. In shock+ligation group and shock+drainage group, the vascular rings were incubated with Rho kinase agonist angiotensinⅡ or antagonist fasudil before the measurement of the response to gradient calcium ions.RESULTSThe calcium sensitivity of vascular rings in shock group was significantly lower than that in sham group, and that in shock+ligation group and shock+drainage group was significantly higher than that in shock group, but still lower than that in sham group. AngⅡ elevated the contractile activity of the vascular rings in response to gradient calcium ions and the pD2, and fasudil significantly decreased the response to gradient calcium ions and Emaxin shock+ligation group and shock+drainage group. At the same time, fasudil decreased the pD2in shock+ligation group.CONCLUSIONRho kinase plays an important role in blocking shock mesenteric lymph return that improves calcium sensitivity.

Shock,hemorrhagic; Mesenteric lymph duct; Ligation; Mesenteric lymph; Drainage; Calcium sensitivity; Rho kinase

R364.1+4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.003