AMPKα2基因shRNA重組質粒的構建以及在氯離子介導的大鼠心肌缺氧/復氧損傷中的作用*

劉 丹， 孫 惦， 許 旻， 周 敏， 吳曉牧， 何 明△

(1南昌大學醫學院，2江西省人民醫院神經內科，江西南昌330006)

一直以來，人們對心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷機制的研究都聚焦于Ca2+，而Cl－作為機體內最富生理意義的陰離子，其在心肌缺血/再灌注損傷中的作用卻一直未得到重視。本實驗室一直致力于研究Cl－在心肌缺氧/復氧(anoxia/reoxygenation，A/R)損傷中所起的作用，已發現去除細胞外Cl－能通過減少氧化應激而很好地對抗心肌A/R損傷，但具體機制不明。AMP活化的蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)是高度保守的蛋白激酶家族，由于其在調節能量代謝、參與氧化應激等方面的突出作用而日趨引起人們的關注［1］。AMPK是一個由催化亞基α(63 kD)、調節亞基β(30 kD)和 γ(38～63 kD)所構成的異源三聚體［2］。α 亞基含有一個重要的Thr172殘基，是主要的活性基團，磷酸化使AMPK激活［3］。那么AMPK是否與這種由活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導的氯離子動態變化所致心肌急性A/R損傷有關呢?目前還未有文獻報道。為此，本實驗擬用RNA干擾技術，構建pSuper－AMPKα2 shRNA重組質粒，轉染H9c2細胞，并建立A/R損傷模型以模擬I/R損傷，以期探討AMPK在Cl－介導的心肌A/R損傷中所起的作用，為研究心肌I/R損傷機制拓展思想、提供理論和實驗依據。

材料和方法

1 細胞與主要試劑

大鼠H9c2心肌樣細胞:中國科學院細胞庫;pSuper.Retro質粒:美國波士頓大學羅志軍教授惠贈;限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ:NEB;T4 DNA連接酶、凝膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購自Promega;AMPKα2抗體、β－actin抗體及相應II抗購自Santa Cruz;LipofectamineTM2000購自Invitrogen;MEM培養基購自Gibco－BRL;ROS檢測試劑盒購自Beyotime Institute of Biotechnology;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;增強化學發光印跡試劑、硝酸纖維素膜(Amersham)、胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT購自Sigma;其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 質粒構建 在 GenBank中搜索出大鼠AMPKα2 mRNA全長序列(NM_023991)，登陸Ambion公司網站在線設計3條siRNA靶序列，分別為:(1)5’－GCGAGCAACUAUCAAAGAC－3’(764);(2)5’－CCCAAAGCACGCUGUCCAC－3’(1131);(3)5’－ACUCUACCAAGUGAUCAGC －3’(233)。以質粒 pSuper.Retro為載體，限制性內切酶 BamHⅠ、XhoⅠ雙切后，插入帶有黏性末端的 AMPKα2 shRNA核苷酸序列。按小提質粒試劑盒說明操作提取質粒，轉化菌液送北京天根生化科技有限公司測序鑒定。

2.2 重組質粒轉染 轉染前，PBS洗滌細胞2次，盡量去除抗生素和血清，將 LipofectamineTM2000(μL)與 DNA(μL)以 2.0∶0.8 的比例混合，加入到每孔細胞中去，置于培養箱(5%CO2、95%空氣，37℃)中孵育5 h后，換含血清的培養基。以空載質粒載體pSuper為對照。

2.3 重組質粒干擾效率的檢測 為了更好地提高干擾效率，將3個含AMPKα2基因序列特異性shRNA 的重組質粒(pSuper－AMPKα2 shRNA1，pSuper－AMPKα2 shRNA2，pSuper－ AMPKα2 shRNA3)同時轉染到心肌細胞 H9c2中，Western blotting檢測AMPKα2的蛋白表達水平。

2.4 缺氧液、復氧液及去除細胞外Cl－(Cl－－free)液的配制 缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，98.5 mmol·L－1NaCl，10.0 mmol·L－1KCl，40 mmol·L－1乳酸鈉，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;復氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，129.5 mmol·L－1NaCl，5.0 mmol·L－1KCl，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4;Cl－－free缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸鈣，98.5 mmol·L－1葡萄糖酸鈉，10.0 mmol·L－1葡萄糖酸鉀，40 mmol·L－1乳酸鈉，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;Cl－－free 復氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol· L－1NaHCO3，1.2 mmol· L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸鈣，129.5 mmol·L－1葡萄糖酸鈉，5.0 mmol·L－1葡萄糖酸鉀，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4。

2.5 實驗分組 (1)正常對照(control)組:去除原培養基，換用復氧液置于培養箱(5%CO2、95%空氣，37℃)3 h，再換上復氧液孵育2 h;(2)A/R組:去除原培養液，換用模擬缺氧缺糖溶液將培養板置于持續95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h，再換上模擬再灌注液，95%O2、5%CO2進行復氧孵育2 h(37℃);(3)去除細胞外Cl－的A/R(Cl－－free A/R)組:將缺氧、復氧液換成 Cl－－free缺氧液和Cl－－free復氧液，其余操作與A/R組一致;(4)pSuper+Cl－－free A/R組:空載質粒p pSuper轉染至心肌細胞中，24 h后處理同A/R組;(5)pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R 組:重組質粒pSuper－AMPKα2 shRNA轉染至心肌細胞中，24 h后處理同A/R組。

2.6 Western blotting檢測 實驗結束后，三去污劑裂解液裂解細胞，提取總蛋白，同等量蛋白質完成SDS－PAGE后，進行電轉膜，再結合I抗、II抗，最后X線膠片曝光分析。

2.7 細胞存活率 采用MTT比色法檢測。胰酶消化后收集細胞，每組細胞以1×104cells/well濃度接種于96孔培養板中。細胞覆蓋率達70%～80%后吸出培養基。每孔加入 MTT溶液(5 g·L－1溶于PBS)20 μL，37 ℃孵育 4 h。吸棄上清液，每孔加DMSO 150 μL振蕩10 min，使藍色結晶充分溶解。490 nm波長測定其吸光度值即A值，以間接反映各組活細胞數量。

2.8 生化檢測 實驗結束后各組分別取孵育液200 μL，Beckman生化自動分析儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性。

2.9 細胞凋亡檢測 處理結束后，收集細胞，在細胞懸液中加入10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入300 μL binding buffer，立即進行流式細胞儀檢測。

2.10 細胞內ROS含量檢測 實驗結束后，用4℃預冷的PBS洗滌細胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細胞后收集，將配制好的10 μmol/L DCFH－DA溶液500 μL重懸細胞，37℃孵育30 min，800×g離心5 min，棄上清，預冷的PBS洗滌細胞2～3次，制成1×108cells/L的懸液，立即進行流式細胞儀檢測，以488 nm為激發波長，以530 nm為發射波長。以不加DCFH－DA的1管為陰性對照。

2.11 細胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性測定 處理結束后，消化收集心肌細胞，反復凍融破碎細胞，離心后取上清液，按試劑盒說明書進行操作。

3 統計學處理

應用SPSS 11.5統計軟件行組間方差分析，數據以均數±標準差(ˉx±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 重組質粒測序鑒定

轉化菌液經北京天根生化科技有限公司測序，結果表明shRNA序列成功構建于pSuper.Retro質粒表達載體上，結果完全符合設計要求，見圖1。

Figure 1.Sequencing of recombinant plasmids pSuper－ AMPKα2 shRNA1，pSuper－ AMPKα2 shRNA2 and pSuper－ AMPKα2 shRNA3(partial).圖1 重組表達質粒測序鑒定結果

2 重組質粒干擾效果的檢測

Control組AMPKα2蛋白在H9c2細胞中呈基礎性表達;轉染空載質粒pSuper后AMPKα2蛋白表達與control組比較無明顯差異;而轉染重組質粒pSuper－AMPKα2 shRNA 之后 AMPKα2蛋白表達則顯著降低(P＜0.01)，見圖2，提示重組RNA干擾質粒能有效降低AMPKα2蛋白表達。

Figure 2.Silencing efficiency of pSuper－ AMPKα2 shRNA detected by Western blotting.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group.圖2 Western blotting檢測pSuper－AMPKα2 shRNA的沉默效率

3 各處理組對心肌細胞存活率和LDH活性的影響

A/R組與control組比較，細胞存活率明顯下降，LDH活性明顯升高(P＜0.01);Cl－－free A/R組與A/R組相比，細胞存活率明顯升高，LDH活性明顯下降(P＜0.01)，提示Cl－－free液對心肌細胞損傷有保護作用;轉染重組質粒pSuper－AMPKα2 shRNA則明顯阻斷了Cl－－free液的這種保護作用，細胞存活率下降，LDH活性升高，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表 1。

4 各處理組對心肌細胞凋亡的影響

A/R組較之control組，細胞凋亡明顯增加(P＜0.01);Cl－－freeA/R組與A/R組比較，細胞凋亡明顯減輕(P＜0.01)，提示去除細胞外Cl－能對抗心肌A/R損傷;轉染重組質粒的pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R組與未轉染質粒組和轉染空載質粒組相比，細胞凋亡進一步明顯升高(P＜0.01)，提示pSuper－AMPKα2 shRNA重組質粒能阻斷Cl－－free液對抗心肌細胞A/R損傷的作用，見圖3。

表1 AMPKα2低表達對各處理組心肌細胞存活率和LDH活性的影響Table 1.Effect of down－regulation of AMPKα2 on viability and LDH activity of cardiomyocytes in each group(ˉx±s.n=6)

5 各處理組對心肌細胞ROS生成的影響

H9c2心肌細胞經A/R處理后，與control組比較ROS含量明顯升高(P＜0.01);Cl－－free A/R與A/R組相比，ROS含量顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，提示Cl－－free能減少A/R損傷所致的ROS爆發;pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R組與未轉染組相比，則能明顯增加ROS的生成(P＜0.01)，提示 pSuper－AMPKα2 shRNA 重組質粒能阻斷Cl－－free抑制A/R損傷致ROS生成增加的作用，見圖4。

6 各處理組對心肌細胞抗氧化物酶SOD及GSHPx活性的影響

A/R組與control組比較，細胞內抗氧化物酶SOD及GSH－Px活性顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01);Cl－－free A/R組與A/R組相比，細胞內SOD及GSH－Px活性顯著升高(P＜0.01)，而轉染重組質粒pSuper－AMPKα2 shRNA后，SOD及GSH－Px活性再次下降，提示重組質粒的轉染阻斷了Cl－－free對心肌細胞內抗氧化酶的保護作用，見表2。

討 論

研究發現，Cl－在心肌低滲、缺血缺氧、應急刺激等異常條件下，可引起心律失常并對心功能產生較大影響［4］。Lai等［5］利用離子敏感型玻璃微電極記錄技術，成功觀察到心肌缺血時細胞內Cl－濃度急劇增加，進而引發心律失常。本實驗也發現，去除細胞外Cl－行A/R損傷，心肌細胞損傷較未去除細胞外Cl－組比較明顯減輕，表現為細胞存活率升高，凋亡減少，并且Cl－－free對抗A/R損傷的這種保護作用伴隨著ROS生成減少。

Figure 3.Effect of down－regulation of AMPKα2 on apoptosis of cardiomyocytes in each group.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.圖3 AMPKα2低表達對各處理組心肌細胞凋亡的影響

Figure 4.Effect of down－regulation of AMPKα2 on ROS production of cardiomyocytes in each group.ˉx±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.圖4 AMPKα2低表達對各處理組心肌細胞ROS生成的影響

表2 AMPKα2低表達對各處理組心肌細胞SOD和GSHPx活性的影響Table 2.Effect of down－regulation of AMPKα2 on SOD and GSH－Px activity in cardiomyocytes in each group(ˉx±s.n=6)

ROS被認為在維持心血管穩態方面有著十分重要的生理和病理生理作用，ROS的大量產生是導致心肌I/R急性損傷的主要因素之一［6］。由于ROS主要是在線粒體中產生，與能量代謝密切相關［7］，且有學者發現［8］，在β細胞中AMPK的持續激活可引起ROS的產生增加;有鑒于此，我們高度懷疑 Cl－－free對抗心肌A/R損傷的機制與AMPK有關。

RNAi是近年來新興的研究生物體基因表達、調控與功能的技術手段，其分子機制是真核生物細胞在轉錄后引發的基因沉默，RNAi作為一種反向遺傳學手段已經在基因功能研究中廣泛應用［9］。本實驗同時將3條靶序列共轉染入H9c2細胞，以減少單一siRNA脫靶失效的幾率，效率最大化的特異性沉默AMPKα2在H9c2心肌細胞內的表達。結果發現，AMPKα2表達被抑制后，Cl－－free對心肌細胞A/R損傷的保護作用被取消，并且ROS生成再度升高，氧化應激損害加重。綜上所述，本實驗成功構建了重組質粒 pSuper－AMPKα2 shRNA，并證實了 Cl－－free可以對抗心肌細胞 A/R損傷，其機制與AMPKα2抑制ROS生成、降低氧化應激水平有關。

［1］ Hardie DG，Ross FA，Hawley SA.AMPK:a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(4):251 －262.

［2］ Kim M，Tian R.Targeting AMPK for cardiac protection:Opportunities and challenges［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51(4):548－553.

［3］ Webster I，Friedrich SO，Lochner A，et al.AMP kinase activation and glut4 translocation in isolated cardiomyocytes［J］.Cardiovasc J Afr，2010，21(2):72 －78.

［4］ Duan DD.The ClC－3 chloride channels in cardiovascular disease［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(6):675 －684.

［5］ Lai ZF，Nishi K.Intracellular chloride activity increases in guinea pig ventricular muscle during stimulated ischemia［J］.Am J Physiol，1998，275(5 Pt 2):H1613 －H1619.

［6］ 劉興奎，段忠心，喻 田.缺血后處理對離體大鼠心肌線粒體功能的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(2):229－233.

［7］ Dai DF，Hsieh EJ，Liu Y，et al.Mitochondrial proteome remodelling in pressure overload－induced heart failure:the role of mitochondrial oxidative stress［J］.Cardiovasc Res，2012，93(1):79－88.

［8］ Cai Y，Martens GA，Hinke SA，et al.Increased oxygen radical formation and mitochondrial dysfunction mediate beta cell apoptosis under conditions of AMP－activated protein kinase stimulation［J］.Free Radic Biol Med，2007，42(1):64－78.

［9］ Perkel JM.RNAi therapeutics:the teenage years［J］.Biotechniques，2012，52(6):355 －357.