白藜蘆醇對抗D－半乳糖誘導的心肌細胞衰老及其機制*

過華蕾， 廖麗貞， 陳燕玲， 吳偉康

(中山大學中山醫學院病理生理教研室，廣東廣州510080)

衰老是一種正常的生物學現象，衰老的過程伴隨著氧化損傷的增強，增殖阻滯，端粒酶縮短等。因而隨著衰老的發生，各種年齡相關疾病的發病率大大增加，特別是心血管疾病。細胞是組成生物體的基本單位，細胞衰老引起組織器官的功能喪失，最終引致生物的衰老［1－2］。心肌細胞的衰老伴隨著心肌收縮力下降，心輸出量減少，最終導致心功能障礙，心血管疾病發生。建立細胞水平的衰老模型對于我們研究衰老以及尋找對抗衰老的方法都具有重要意義。目前，細胞水平的衰老模型有體外傳代法、腫瘤壞死因子誘導法、過氧化物誘導法、D－半乳糖誘導法等［3］。

細胞外高D－半乳糖環境可以使細胞內半乳糖濃度升高，D－半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，這種物質不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹、代謝紊亂、功能喪失，最終引起衰老。此外，D－半乳糖代謝過程中產生的自由基也可以促進衰老的發生。D－半乳糖作為促老劑已在國內外廣泛應用，王琳等［3－4］研究發現D－半乳糖對體外原代心肌細胞擬衰老作用，為本實驗造模提供了理論依據。Dimri等［5］首次提出β－半乳糖苷酶可作為一種鑒定衰老的生物學指標。近年來，衰老相關的β－半乳糖苷酶染色已成為一個公認指標，廣泛應用于衰老的檢測。

白藜蘆醇(resveratrol)是一種廣泛存在于葡萄皮、花生、虎杖、藜蘆、決明等植物中的多酚類化合物。它具有許多生物學作用，包括抗癌、保護心血管系統、保護缺血后的腦損傷、調節免疫反應、抗衰老等［6］。然而，白藜蘆醇對衰老的原代心肌細胞的效應尚未見報道。本實驗采用D－半乳糖建立體外心肌細胞衰老模型，通過衰老、自由基和自噬相關指標的檢測，探討白藜蘆醇對衰老心肌細胞影響及其可能的機制。

材料和方法

1 動物

SD乳鼠(出生3 d以內，雌雄不限)，購自中山大學實驗動物中心。

2 主要試劑

DMEM(低糖)培養基和M199培養基為杭州吉諾生物公司產品，胎牛血清和馬血清為HyClone產品，Ⅱ型膠原酶為Gibco產品。D－半乳糖、熒光素二(β－D－吡喃半乳糖苷)［fluorescein di(β－D－galactopyranoside)，FDG］、噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和單克隆小鼠β－actin抗體均購自Sigma。β－半乳糖苷酶染色試劑盒和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule－related protein 1 light chain 3，LC3)抗體購自CST。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒和細胞丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？故蠹翱雇玫倪B接辣根過氧化物酶的IgG(H+L)購自Vector，超敏發光液(enhanced chemiluminescence，ECL)為普利萊基因技術有限公司產品，顯影液和定影液為中科愛比西科技發展有限公司產品。

3 方法

3.1 原代心肌細胞的培養 出生3 d以內的SD大鼠，70%乙醇消毒處死后，用小彎鑷取心尖組織，DHanks液洗3次，用彎鑷去除心包膜，剪碎，Ⅱ型膠原酶消化數次，每次15 min。收集細胞懸液入皿中，37℃恒溫培養箱差速貼壁1.5 h以清除非心肌細胞。收集細胞懸液稀釋到3×105，加入10－4mol/L濃度5’－溴脫氧尿嘧啶以抑制成纖維細胞生長，37℃恒溫培養箱培養24 h以貼壁。顯微鏡下可見心肌細胞貼壁融合生長，跳動頻率約 90 ～120 min－1［7－8］。

3.2 MTT比色法測細胞活力 將心肌細胞按3×105密度接種到96孔板，每組設5個復孔。待細胞貼壁后按實驗分組加入藥物處理。48 h后每孔避光加入5 g/L MTT 20 μL，混合均勻后置于37℃、5%CO2培養箱中孵育4 h后，吸走上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜 DMSO以溶解結晶，搖床振蕩10 min，使充分混勻。采用酶標儀測定各孔A(492 nm)值，評價細胞存活率。

3.3 β－半乳糖苷酶染色法 將心肌細胞按3×105密度接種到6孔板，每組設5個復孔。待細胞貼壁后按對照組和衰老組(10 g/L D－半乳糖處理48 h)處理。48 h后吸走培養基，用PBS沖洗2次，室溫下用2%甲醛與0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS沖洗2遍。加入含20 g/L X－Gal(X－Gal溶于DMF)的染色液(染色液按照試劑盒說明配成)，無CO2、37℃恒溫培養孵育24 h，研究級倒置光學顯微鏡下可見衰老細胞胞質呈現藍色，為染色陽性細胞。于倒置顯微鏡(×200)下拍照，并對視野內染色陽性的細胞計數，每孔3個隨機視野，每組設5個復孔。

3.4 FDG法檢測β－半乳糖苷酶含量 FDG是一種β－半乳糖苷酶特異性熒光底物，FDG 5 mg溶于38 μL雙蒸水與 DMSO混合液中(1∶1)制成200 mmol/L母液(－20℃可保存數月)。將心肌細胞按3×105密度接種到96孔板，每組5個復孔。細胞貼壁后加入藥物處理。48 h后吸走培養基，用PBS沖洗2次，室溫下用2%甲醛與0.2%戊二醛混合液固定10～15 min。吸走固定液，PBS沖洗2遍。避光每孔加入 100 μL反應液(37 mmol/L檸檬酸，126 mmol/L磷酸氫二鈉，5 mmol/L鐵氰化鉀，5 mmol/L亞鐵氰化鉀，150 mmol/L氯化鈉，2 mmol/L氯化鎂)與10 μL 2 mmol/L FDG無CO2、37℃恒溫培養孵育24 h，吸取反應液100 μL入96孔黑板，多功能酶標儀讀取熒光強度(預讀，波段485～535 nm)。此法可半定量地檢測β－半乳糖苷酶的含量，作為衰老程度鑒定的指標［9－10］。

3.5 心肌細胞SOD和MDA水平檢測 細胞外液SOD和細胞中MDA的水平使用南京建成SOD測定試劑盒(WST－1法)和細胞MDA測定試劑盒進行檢測［11］。

3.6 Western blotting檢測 將每組蛋白按照總量80 μg計算出上樣體積，加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min后，2 000 r/min離心1 min，然后上樣，并加5 μL蛋白marker作為分子量指示。電泳:恒壓80 V 30 min，100 V 1 h。電泳完畢后，按“夾心三明治”方式將膠與PVDF膜(使用前在甲醇中浸泡5 s左右)夾在一起，冰浴中恒壓100 V 1 h電轉。用5%TBST脫脂牛奶溶液將電轉后的PVDF膜室溫封閉1 h，將含目的條帶的PVDF膜浸沒在LC3Ⅰ抗滴度均為1∶1 000的5%TBST脫脂牛奶溶液中，4℃搖床孵育過夜。β－actin抗體(1∶10 000)作為內參判斷各組間的上樣量是否一致。Ⅰ抗孵育完畢后，室溫下TBST洗膜5次，每次8 min。加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。Ⅱ抗滴度均為1∶2 000。Ⅱ抗孵育結束后用TBST洗膜3次，每次10 min。于暗室加上ECL發光液用X膠片曝光，于顯影液、定影液中獲得顯影膠片。X膠片上的目的條帶經過掃描儀掃描后，使用ImageJ軟件進行條帶灰度的半定量分析。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(ˉx±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 心肌細胞衰老模型的建立

D－半乳糖誘導心肌細胞衰老，分別用0.1 g/L、1 g/L、10 g/L和100 g/L濃度處理48 h，用 MTT法測定細胞活力，FDG法檢測β－半乳糖苷酶的含量，作為衰老程度鑒定的指標。在10 g/L濃度時，細胞活力沒有受到影響，β－半乳糖苷酶含量增加，見表1。再用10 g/L D－半乳糖分別處理12 h、24 h、48和72 h，MTT法檢測細胞活力，FDG法檢測β－半乳糖苷酶的含量，見表2。在10 g/L D－半乳糖處理48 h這一條件下，心肌細胞活力良好，與對照組比差異沒有統計學意義，但β－半乳糖苷酶的含量明顯增加，因此選擇10 g/L D－半乳糖處理48 h作為心肌細胞衰老造模條件。后面的實驗衰老模型組均采用這一條件。

表1 不同濃度D－半乳糖誘導組β－半乳糖苷酶含量及細胞活力的比較Table 1.β－galactosidase level and cell viability in different concentrations of D－galactose treatment groups(ˉx±s.n=5)

表2 D－半乳糖誘導不同時間組β－半乳糖苷酶含量及細胞活力的比較Table 2.β－galactosidase level and cell viability in different time of D－galactose treatment groups(ˉx±s.n=5)

2 衰老的鑒定

在光學顯微鏡下對造模成功的細胞進行形態學檢查，可以觀察到衰老的心肌細胞形狀扁平，胞體變大，呈卷簾樣變化，跳動頻率減慢。β－半乳糖苷酶染色可見對照組僅少量細胞染色陽性(藍色)，而衰老模型組染色陽性細胞數明顯增多，見圖1。

3 白藜蘆醇對衰老心肌細胞的影響

將細胞分為對照組、衰老組(10 g/L D－半乳糖處理48 h)和白藜蘆醇(RESV)處理組(分別以2 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L 和 250 μmol/L 濃度白藜蘆醇預處理30 min后加入D－半乳糖，以及白藜蘆醇與D－半乳糖同時孵育)，加入FDG，熒光酶標法檢測白藜蘆醇對衰老心肌細胞的影響，見圖2。與衰老組相比，白藜蘆醇10 μmol/L及50 μmol/L處理組的β－半乳糖苷酶含量明顯減少。預處理組與同時孵育組相比，預處理組沒有表現出更強的抗衰老效應。

Figure 1.Identification of D－galactose(10 g/L for 48 h)－induced senescence in cardiomyocytes.A:β－galactosidase staining of cardiomyocytes(×200);B:β－galactosidase－positive cardiomyocyte count;C:beating rate of cardiomyocytes.ˉx±s.n=5.*P ＜0.05 vs control group.圖1 D－半乳糖誘導的心肌細胞衰老的鑒定

Figure 2.The anti－aging effect of resveratrol(RESV).Senescence－associated β －galactosidase was measured by fluorescence intensity.Cardiomyocytes were pretreated with RESV for 30 min and then subject to D－galactose for 48 h.On the other hand，cardiomyocytes were coincubate with RESV and D －galactose for 48 h.In control and D －galactose groups，cardiomyocytes were treated with vehicle and D －galactose for 48 h，respectively.ˉx±s.n=5.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs D －galactose group.圖2 白藜蘆醇抗衰老效應圖

4 白藜蘆醇對衰老心肌細胞SOD和MDA水平的影響

將細胞分為對照組、衰老組和白藜蘆醇處理組(取對衰老原代心肌細胞有保護作用的10 μmol/L和50 μmol/L的濃度，與D－半乳糖同時加入)，檢測細胞外液SOD和細胞中MDA的水平。根據SOD測定試劑盒MDA測定試劑盒操作說明進行檢測，可見衰老組SOD水平比對照組降低，而白藜蘆醇處理組比衰老組SOD水平顯著升高;衰老組MDA水平比對照組升高，而白藜蘆醇處理組比衰老組MDA水平顯著降低，見表3。

表3 白藜蘆醇對衰老心肌細胞SOD活性和MDA含量的影響Table 3.Activity of SOD and MDA level in aging and resveratrol treatment groups(ˉx±s.n=5)

5 白藜蘆醇對衰老心肌細胞自噬水平的影響

將細胞分為對照組、衰老組、白藜蘆醇處理組(取對衰老原代心肌細胞有保護作用的10 μmol/L和50 μmol/L的濃度，與D－半乳糖同時加入)和白藜蘆醇空白對照組。刮下細胞，充分裂解后，Western blotting技術檢測各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平，可見衰老組細胞自噬水平下調，而白藜蘆醇處理組自噬水平上調，見圖3。

Figure 3.Protein level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰin aging and resveratrol treatment groups.ˉx±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs D － galactose group.圖3 白藜蘆醇對衰老心肌細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平的影響

討 論

本實驗用D－半乳糖誘導原代心肌細胞衰老，確定了在10 g/L D－半乳糖培養48 h這一條件下，心肌細胞活力沒有受到影響，β－半乳糖苷酶含量明顯增加。同時發現白藜蘆醇在 10 μmol/L和 50 μmol/L的濃度下減少了D－半乳糖誘導的原代心肌細胞β－半乳糖苷酶含量增加的程度。此結果表明在白藜蘆醇的作用下，D－半乳糖誘導的發生衰老心肌細胞數明顯減少，白藜蘆醇對衰老心肌細胞具有保護效應。

SOD能清除細胞中過多的氧自由基，其活力高低可間接反映細胞清除氧自由基的能力;MDA是自由基損傷不飽和脂肪酸生成的中間產物，其含量能間接證明細胞內自由基的水平。細胞內自由基產生增多，而清除自由基的相關酶活性下降，是衰老發生的重要機制［12］。本實驗結果表明D－半乳糖作用可使細胞抗氧化能力降低，細胞內自由基含量升高。白藜蘆醇具有酚羥基結構，與自由基清除劑維生素E活性結構相似，但其活性明顯強于維生素E，具有很強的自由基清除能力和抗脂質過氧化效應。白藜蘆醇可以對抗D－半乳糖處理產生的效應，提高SOD水平，降低細胞內MDA含量。由此可以證明，D－半乳糖誘導的心肌細胞衰老與氧化應激損傷和自由基毒性相關。白藜蘆醇對抗衰老的效應部分是因為其良好的抗氧化作用改善了細胞的氧化應激狀態，提高細胞的抗氧化能力所致［13］。

細胞內損傷物質的積累是所有衰老的普遍特征，導致生命有機體生存能力降低。在衰老過程中，自噬選擇性地清除某些細胞成分，如受損或多余的過氧化物酶體和細胞器，維持細胞自我穩態，而一些細胞器經包裹分解后又可以再利用。盡管自噬曾被廣泛認為是細胞的一種自我消亡方式［14］。但越來越多的研究結果表明，自噬起的是一種保護細胞的作用，在營養缺乏、缺氧、內質網應激、異常蛋白堆積和DNA損傷的情況下，保存細胞能量，循環利用蛋白和細胞器，增強線粒體功能，防止細胞走向凋亡和壞死。衰老的過程伴隨著細胞自噬活動的下調。自噬活動不足促進衰老的發生。自噬活動增強具有抗衰老的作用［15－16］。白藜蘆醇作為SIRT1的激活劑，近年來因為其抗衰老的效用而獲得廣泛關注。白藜蘆醇能通過激活SIRT1信號通路來抑制mTOR，上調自噬水平，從而發揮抗衰老作用［17－18］。

衰老是一個正常的生理過程，但各種年齡相關疾病的高發病率使得研究者從未減少對衰老的關注。建立體外心肌細胞衰老模型對觀察衰老心肌細胞對外界刺激因素的反應，篩選具備抗衰老效應的藥物都具有重大意義。本研究結果為白藜蘆醇通過抗氧化應激及上調自噬來對抗衰老提供了實驗依據。

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