栗疫病病原菌致病性及生長特性研究

何秀娟，徐育海，楊曉平 (湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430209)

谷 超 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

栗疫病病原菌致病性及生長特性研究

何秀娟，徐育海，楊曉平 (湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430209)

谷 超 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

從湖北大別山板栗產(chǎn)區(qū)受栗疫病侵染栗園中分離出栗疫病病原菌4株，對各菌株的致病性和生長特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：不同菌株的致病性存在顯著差異，其中C菌株致病力最強(qiáng)，接種到板栗枝條15d發(fā)病率達(dá)100%，病斑面積顯著大于其他菌株；不同菌株在不同碳源營養(yǎng)和氮源營養(yǎng)條件下生長特性亦不相同：在PDA培養(yǎng)基上，C菌株菌絲生長最快；在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上各菌株生長良好，以甘氨酸和尿素為氮源則無法生長；在以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上各菌株均能迅速生長，以可溶性淀粉為碳源則生長緩慢且菌絲稀薄。

栗疫病；致病性；氮源；碳源

栗疫病是由子囊菌亞門的栗疫病菌即寄生隱叢赤殼菌[Cryphonectriaparasitica(Murr.)Barr]引起的一種真菌性病害，是世界上最著名的森林病害，20世紀(jì)初幾乎完全毀滅了美洲栗[1]，歐洲各國的歐洲栗生產(chǎn)也蒙受巨大損失。中國板栗一直被認(rèn)為是對栗疫病抗性最強(qiáng)的一個(gè)種[2]，但不同的品種資源抗性不同。我國學(xué)者早已在國內(nèi)多個(gè)省市發(fā)現(xiàn)此病[3-4]，且已造成了不同程度的危害，部分地區(qū)發(fā)病率高達(dá)60%，被害板栗樹輕則樹勢衰弱，影響產(chǎn)量，重則樹干潰爛，全株死亡。由此，栗疫病的防治研究亦成為我國板栗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展所不容忽視的問題。本研究從湖北省大別山板栗產(chǎn)區(qū)受栗疫病侵染栗園分離出栗疫病病原菌4株，研究其致病性和在不同碳源營養(yǎng)和氮源營養(yǎng)條件下生長特性，以期為栗疫病的防治研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

栗疫病病原菌采自湖北省羅田縣受栗疫病侵染的板栗園，選擇具有典型栗疫病癥狀的枝干，刮取病斑樹皮裝入樣品袋，帶回實(shí)驗(yàn)室供病原菌分離。供病菌接種用的健康板栗枝條采自湖北省農(nóng)科院果樹茶葉研究所板栗資源圃內(nèi)，品種為‘金栗王’，選取二年生枝條，直徑8mm左右。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和查氏培養(yǎng)基(Czapek’s medium)[5]。

1.2 病原菌的分離

按常規(guī)組織分離法，從自然發(fā)病的栗疫病樹皮中進(jìn)行組織分離，單孢純化，培養(yǎng)保存。對分離出的菌株，根據(jù)柯赫氏法則，回接到健康的板栗枝條上，觀察能否產(chǎn)生典型的栗疫病病斑，并從新的病斑處重新分離致病菌，確認(rèn)致病菌與原菌株特征一致。

1.3 分離菌株在PDA平板上的生長特性觀察

將病原菌株接種于PDA平板上，25℃光照培養(yǎng)7d后，在菌落邊緣用6mm打孔器打取幼嫩菌絲塊，置于新鮮的PDA平板上25℃光照培養(yǎng)。每天同一時(shí)間采用十字交叉法測量菌落直徑，并觀察和記載菌落顏色及厚度。培養(yǎng)2周后，在平板上倒入20ml無菌水于25℃浸泡30min，過濾，血球計(jì)數(shù)板測量產(chǎn)孢量。每處理重復(fù)3次。

1.4 不同菌株致病力的比較

試驗(yàn)品種為‘金栗王’，將采集的枝條殺菌消毒后晾干，用5mm打孔器在枝條上打孔，深至木質(zhì)部，取出樹皮，將5mm菌絲塊接種于板栗枝條孔內(nèi)，于25℃光照保濕培養(yǎng)，7d后移除菌絲塊，從第10d開始觀察各處理枝條發(fā)病特征、發(fā)病率，記錄病斑縱橫徑，以橢圓面積公式計(jì)算出病斑面積，每5d記錄1次，直至4周。以空白瓊脂塊為對照，每處理重復(fù)3次。

Characteristics of Rossby wave packets in non-ENSO years and their possible impacts on severe precipitation

1.5 不同氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)。以葡萄糖30g/L為碳源，分別加入尿素、硝酸鈣、蛋白胨、硝酸銨、酵母膏、甘氨酸、硝酸鉀、硫酸銨等2g/L為氮源，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基為對照。取6mm菌絲塊移植于不同氮源培養(yǎng)基上，25℃恒溫光照培養(yǎng)，逐日測量菌落直徑并觀察和記載菌落顏色及厚度，培養(yǎng)2周后測量產(chǎn)孢量。每處理重復(fù)3次。

1.6 不同碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)。以2g/L酵母膏為氮源，分別加入葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉等30g/L為碳源，不加碳源的查氏培養(yǎng)基作為對照。實(shí)驗(yàn)方法同1.5。

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

Ι為自然侵染栗疫病癥狀；Π為C菌株接種后發(fā)病癥狀；Ш為D菌株接種后發(fā)病癥狀； IV為F菌株接種后發(fā)病癥狀；V為I菌株接種后發(fā)病癥狀。

2.2 不同菌株在PDA平板上的生長特性

不同菌株在PDA平板上培養(yǎng)，菌落直徑、日生長速率、產(chǎn)孢量、菌落顏色以及菌落厚度差異明顯。C菌株菌絲生長速率顯著高于其他菌株，菌絲白色，且菌落較厚，產(chǎn)孢慢，到第20d時(shí)方能看到少許孢子，平板反面黃色；D菌株菌絲生長速率較慢，邊緣菌絲為白色，中心為橙黃色，菌落較C菌株薄，產(chǎn)孢快，第7d能檢測到大量孢子，平板反面黃色；F菌株菌絲生長速率在C菌株和D菌株之間，菌絲黃色，菌落較D菌株略厚，產(chǎn)孢快，培養(yǎng)第7天能檢測到孢子產(chǎn)生，平板反面黃色；I菌株菌絲生長速率最小，菌絲黃色，菌落較薄，產(chǎn)孢快，第7d時(shí)測得產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株，平板反面黃色。

表1 不同菌株P(guān)DA培養(yǎng)第7d生長特性

2.3 不同菌株的致病力

不同菌株在‘金栗王’品種枝條上致病力有顯著差異。菌株C接種病菌后，7d時(shí)傷口周圍出現(xiàn)凹陷病斑，橙紅色，邊緣清晰，表皮病斑擴(kuò)散快，傷口長出菌絲初為白色，逐漸變厚轉(zhuǎn)為黃色，15d病斑處著生大量突起，新長出黃色菌絲；菌株D接種10d傷口周圍開始出現(xiàn)褐色凹陷病斑，并可見稀薄黃色菌絲，菌絲慢慢變厚，但厚度小于菌株C，褐色病斑擴(kuò)散較慢，病斑處表皮逐漸轉(zhuǎn)為銹紅色；菌株F接種后15d傷口周圍開始出現(xiàn)褐色凹陷病斑，病斑在表皮擴(kuò)散慢，除去表皮能看到韌皮部轉(zhuǎn)為褐色，20d傷口處見少量黃色菌絲，病斑變?yōu)楹旨t色，病斑周圍出現(xiàn)少量突起；菌株I接種后15d傷口周圍出現(xiàn)病斑，20d傷口周圍有凹陷病斑，褐紅色，擴(kuò)散慢，傷口處菌絲深黃色，菌絲較菌株F厚。病菌接種后培養(yǎng)第20d比較各菌株發(fā)病特征，菌株C的發(fā)病率和病斑直徑顯著高于其他菌株(表2)。

表2 不同菌株接種枝條20d后發(fā)病特征

2.4 不同氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

橫坐標(biāo)軸中，1為無氮源，2為硝酸鈣，3為蛋白胨，4為硝酸銨，5為酵母膏，6為硝酸鉀，7為硫酸銨；各氮源處理對應(yīng)的散點(diǎn)中，符號一致的散點(diǎn)自下而上分別表示同一菌株在該氮源培養(yǎng)基上生長第4d、5d、6d、7d和第8d時(shí)的菌落直徑。

將4個(gè)菌株在不同氮源培養(yǎng)基上生長4～8d之間的菌落直徑作散點(diǎn)圖(圖2)，菌株的產(chǎn)孢量和菌落特征見表3。菌落生長檢測結(jié)果表明，各菌株能利用多種氮源，在無氮條件下也能生長，但在尿素和甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上均不能生長；酵母膏是最有利的氮源，菌絲生長速率和菌落厚度顯著高于其他氮源；各菌株在無機(jī)氮源培養(yǎng)基上生長緩慢且菌絲稀薄。C菌株產(chǎn)孢慢，第15d時(shí)黃色子座稀少，僅在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上測得少量孢子產(chǎn)生；D菌株在酵母膏培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量孢子，在其他處理中產(chǎn)孢稀少；F菌株和I菌株在以酵母膏為氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，其他氮源與無氮培養(yǎng)基產(chǎn)孢量無明顯差異，或檢測不到孢子。

表3 不同氮源對各病原菌株生長的影響

2.5 不同碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

橫坐標(biāo)軸中，1為無碳源，2為葡萄糖，3為蔗糖，4為乳糖，5為麥芽糖，6為可溶性淀粉；各碳源處理對應(yīng)的散點(diǎn)中，符號一致的散點(diǎn)自下而上分別表示同一菌株在該氮源培養(yǎng)基上生長第4d、5d、6d和第7d時(shí)的菌落直徑。

以酵母膏為氮源，4個(gè)菌株在不同碳源培養(yǎng)基上生長4～7d的菌落直徑作散點(diǎn)圖(圖3)，菌株產(chǎn)孢量和菌落特性見表4。菌落生長檢測結(jié)果表明，4個(gè)菌株能有效利用多種碳源，在不同碳源和無碳處理中都能生長，在可溶性淀粉和無碳培養(yǎng)基上生長菌絲極為稀薄。不同菌株對不同碳源的利用存在差異，C菌株在不同碳源上均能迅速生長且生長速率較其他菌株最快，菌落厚，對麥芽糖和葡萄糖的利用好于其他碳源；不同碳源培養(yǎng)基上，D菌株在蔗糖和乳糖培養(yǎng)基上菌落生長較快，生長速率和菌落厚度僅次于C菌株；F菌株對可溶性淀粉的利用最差，略低于無碳處理；I菌株對葡萄糖的利用好于其他碳源，可溶性淀粉處理和無碳處理無差異。菌株C在不同碳源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢時(shí)間較其他菌株晚，到第15d時(shí)未能測出孢子，不同碳源對各菌株產(chǎn)孢量的影響與菌絲生長相似。

表4 不同碳源對各病原菌株生長的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，4個(gè)栗疫病病原菌株在PDA上的生長速率、菌落顏色、菌落厚度及產(chǎn)孢量均存在顯著差異，接種到‘金栗王’板栗枝條上發(fā)病率和病斑擴(kuò)散速率也不相同。進(jìn)一步印證了栗疫病菌存在豐富的遺傳多樣性和致病力多樣性。其中C菌株致病力最強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)100%且病斑擴(kuò)散迅速，在PDA培養(yǎng)基上C菌株菌絲白色，生長迅速，菌落厚。

碳源和氮源利用研究表明，栗疫病病原菌生存能力強(qiáng)，能有效利用多種氮源和碳源，在無碳或無氮條件下也能生長。從本研究結(jié)果看，最佳氮源是酵母膏。在氮源利用實(shí)驗(yàn)中，4個(gè)菌株對無機(jī)氮源的利用不理想，菌絲稀薄且產(chǎn)孢量明顯降低，因此碳源篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建議以酵母膏作為基礎(chǔ)氮源。碳源利用實(shí)驗(yàn)表明，可溶性淀粉不是理想的碳源，由此，可溶性淀粉不宜作為栗疫病菌生長的碳源。

有研究表明甘氨酸和尿素都具有不同程度的抗菌作用[6-8]，本研究中，各菌株在甘氨酸和尿素為氮源的培養(yǎng)基上均不能生長，與無氮源處理相比，甘氨酸和尿素對菌株的生長存在明顯的抑制作用，推測這2種物質(zhì)可能對栗疫病具有一定的防治效果。

在本研究初步研究了培養(yǎng)條件對病原菌培養(yǎng)特征造成的差異，對研究病原菌的生長變化和防治措施具有指導(dǎo)作用，對抑菌物質(zhì)的篩選有待于進(jìn)一步研究。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.01.001

S436.64

A

1673-1409(2012)01-S001-04

2012-01-05

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2010CDA052)。

何秀娟(1982-)，女，湖北天門人，碩士，助理研究員，主要從事板栗栽培育種及病蟲害防治工作。

徐育海，E-mailxuyuhai2003@163.com。